زمینه و هدف: مطالعات متعددی بر روی آنتی ژن ها کلادوسپوریوم هرباروم (ک. هرباروم) نشان داده است که این آنتی ژن ها نقش مهمی در تولید IgE اختصاصی در افراد آتوپیک داشته و موجب بدتر شدن وضعیت کلینیکی این گونه بیماران از جمله درماتیت آتوپیک می شوند. لذا در مطالعه حاضر اجزای آلرژی زای ک. هرباروم با روش ایمونوبلاتینگ مورد بررسی قرار گرفته است. روش بررسی: ک. هرباروم در محیط سابورو دکستروز آگار کشت داده شد. توده میسیلیومی جمع آوری شده با استفاده از ازت مایع و دانه های شیشه ای (glass bead) شکسته شد. سپس نمونه ها سانتریفیوژ شده و محلول رویی (عصاره خام) با روش SDS-PAGE تفکیک شد. پس از انجام بلاتینگ، اجزا پروتئینی با سرم بیماران مورد مطالعه مجاور شدند و باند های پاسخ دهنده به IgE با آنتی بادی های ضد IgEانسانی که به وسیله آنزیم نشان دار شده بود، در یک سوبسترای رنگی نمایان شد. یافته ها: در SDS-PAGE عصاره خام ک. هرباروم تعداد 16 باند با وزن مولکولی بین 15.1 تا110 کیلودالتون را نشان داد. باند های 15.1، 18.4، 25.1، 36.3، 45 و 54 کیلودالتونی به عنوان باندهای قوی معین شدند. در ایمونوبلاتینگ، باندهای پروتئینی با وزن های مولکولی 15.1، 18.4، 42 و 110 کیلودالتونی با IgE سرم های بیماران مبتلا به درماتیت آتوپیک واکنش قوی نشان دادند. نتیجه گیری: نتایج فوق نشان داد که باندهای قوی در SDS-PAGE، بیشترین واکنش را با آنتی بادی های IgE ضد ک. هرباروم در تکنیک ایمونوبلاتینگ داشته اند. لذا قدرت باند ها در SDS-PAGE می تواند در پاسخ به IgE اثرگذار باشد. مانند دیگر مطالعات، ما نیز تصور می کنیم که آنتی ژن های ک. هرباروم می تواند شروع کننده واکنش های آلرژیک در بیماران مبتلا به درماتیت آتوپیک باشد.

مقدمه: امروز از روش های الکتروفورز برای بررسی پروتیین های درون سلولی و ترشحی قارچ ها در رده بندی و جدا سازی گونه های قارچی استفاده می شود. درماتوفیتوزیس، یک بیماری قارچی سطحی بوده، که توانایی تحریک دستگاه ایمنی سلولی و هومورال وایجاد پادتن را دارد. شماری از پروتیین هایی قارچی نیز، خاصیت آنتی ژنی نداشته و در ایجاد ایمنی هوموال نقشی ندارند. هدف از این پژوهش، تعیین الگوی پروتئینی قارچ اپیدرموفیتون فلوکوزوم و شناسایی پروتیین های آنتی ژنیک آن به روش ایمونوبلاتینگ بوده است. روش کار: شمار بیست ایزوله از واریته های آلبینو و پیگمانته اپیدرموفیتون فلوکوزوم از بیماران مبتلا به درماتوفیتوزیس جدا گردید. گونه ها در محیط سابورو مایع دو درصد کشت داده شدند. توده های میسلیومی، در آغاز به وسیله فیلتر جدا گردید و سپس، به روش شن دریایی خرد شدند. عصاره سوماتیک، پس از سانتریفو و دیالیز به وسیله دستگاه فریز - درایر، به صورت پودر درآمد. آنتی ژن به دست آمده، به خرگوش تزریق شده و سطح آنتی بادی به روش کانتر ایمنوالکتروفورز تعیین گردید. الگوی پروتئینی قارچ به روش SDS-PAGE تعیین و ژلهای رنگ آمیزی شده به وسیله دستگاه سنجش تراکم اسکن شدند. برای تعیین پروتئین های آنتی ژنیک اپیدرموفیتون فلوکوزوم، از روش ایمونوبلاتینگ به وسیله سرم خرگوش ایمن شده، سرم بیماران، آنتی سرم کنژوگه خرگوشی IgG و آنتی سرم های کنژوگه انسانی IgG و IgM استفاده گردید. یافته ها: در الگوی پروتیینی واریته های اپیدرموفیتون فلوکوزوم، به روش SDS PAGE، 31 باند پروتئینی با وزن های 12.5 تا 97.5 کیلو دالتون به صورت همانند شناسایی گردید، که از این میان، شمار 23 پروتیین آنتی ژنیک با وزن میان 16 تا 97.5 کیلو دالتون به روش ایمونوبلاتینگ در خرگوش شناسایی گردید. به وسیله سرم کنژوگه IgG انسانی، شمار 14 پروتیین آنتی ژنیک و با سرم کنژوگه IgM انسانی، شمار 15 پروتئین آنتی ژنیک شناسایی شدند. د راین بررسی، انتی ژن های 20.1 و 18.4 کیلو دالتون به وسیله آنتی بادی IgM و آنتی ژن 30 کیلو دالتون به وسیله آنتی بادی IgG به صورت اختصاصی در انسان شناسایی گردیدند. نتیجه: شمار پروتئین های آنتی ژنیک در خرگوش شاید به دلیل انسان دوست بودن این درماتوفیت و یا تزریق آنتی ژنهای حاصل از تخریب سلولی، بیشتر از انسان بوده و شماری از این پروتیین ها در انسان می توانند آنتی بادی اختصاصی ایجاد کنند.

روش ردیابی باندهای پروتئینی پس از وسترن بلات با استفاده از پادتن های نشاندارشده با فلئورسنت در این مطالعه به تفضیل شرح داده شده است. با استفاده از پادتن های نشاندار شده با فلئورسنت، می توان پروتئین هایی را که پس از الکتروفورز به غشا پلی وینیلیدن فلوراید (PVDF) منتقل شدند را در پرتو اشعه ماوراء بنفش آشکار کرده و تصویر آن را به دقت ثبت نمود. نشان گذاری فلئورسنت بدون نیاز به مراحل اضافی جهت رنگ آمیزی، امکان ثبت تصاویر دقیق را فراهم می کند. برای ارزیابی این روش، پادگن های توموری لکوزانزئوتیک گاوی به عنوان مثالی از پروتئین های ایمونوژنیک مورد بررسی قرار گرفت. نتایج این بررسی مشخص کرد که نشان گذاری پادتن ها با فلئورسنت جهت ردیابی پروتئین ها یک روش جایگزین بسیار حساس و قابل اطمینان نسبت به روش های متداول بررسی پروتئین ها در وسترن بلات است.

سابقه و هدف: کاندیدا آلبیکانس از میکروفلورهای محیط واژن می باشد. نحوه واکنش به اجزا آنتی ژنی کاندیدا آلبیکانس در بیماران مختلف، متفاوت بوده و احتمالا در سیر بالینی بیماری می تواند نقش تعیین کننده ای داشته باشد؛ لذا در مطالعه حاضر آنتی بادی های IgE و IgG ایجاد شده بر علیه کاندیدا آلبیکانس در سرم بیماران مبتلا به واژینیت حاد و مزمن کاندیدایی و غیرکاندیدایی با روش ایمونوبلاتینگ مورد بررسی قرار گرفته است.مواد و روش ها: کاندیدا آلبیکانس در محیط سابورو دکستروز آگار کشت داده شد. سلول های مخمری از سطح کشت جمع آوری گردید. پس از شکستن سلول های مخمری، نمونه ها سانتریفوژ گردید (دور 25000 به مدت 5/1 ساعت). قسمت روی محلول به عنوان عصاره خام جدا گردید. سپس عصاره خام با روش SDS-PAGE از نظر پروتیین تفکیک گردید. پس از انتقال پروتیین های تفکیک شده به صفحه نیتروسلوز، اجزا پروتیینی با سرم های بیماران مورد مطالعه مجاور شدند و باندهای پاسخ دهنده به IgE و IgG با آنتی بادی های ضد IgE و IgG انسانی که به وسیله آنزیم، نشان دار شده بود در یک سوبسترای رنگی نمایان شد. یافته ها: در SDS-PAGE تعداد 15 باند پروتیینی مختلف با وزن مولکولی بین 75-13 کیلودالتون شناسایی شد. در ایمونوبلاتینگ، هیچ کدام از باندهای پروتیینی با IgE اختصاصی واکنشی نشان نداد. اما باندهای پروتیینی با وزن های مولکولی 25 و 52 کیلو دالتون با IgG سرم های به دست آمده از بیماران مبتلا به واژینیت مزمن کاندیدایی در 100 درصد موارد واکنش قوی نشان دادند. در صورتی که 100 درصد بیماران مبتلا به واژینیت حاد کاندیدایی تنها با باند پروتیینی 47 کیلو دالتون، واکنش قوی نشان دادند و 55 درصد بیماران مبتلا به واژینیت مزمن غیرکاندیدایی تنها به باند 47 کیلو دالتون، واکنش ضعیف نشان دادند.استنتاج: نتایج مطالعه حاضر نشان داد که آنتی بادی IgG ضد کاندیدایی بر علیه باندهای پروتئینی 25 و 52 کیلو دالتون می تواند با دوره های مزمن و پاسخ نیرومند با آنتی ژن 47 کیلو دالتونی با شکل حاد واژینیت کاندیدایی در ارتباط باشد؛ لذا آشکار ساختن این باندهای پروتیینی در بیماران مبتلا به واژینیت مزمن و حاد می تواند از راه کارهای تشخیصی ولوو واژینیت مزمن و حاد باشد.

مقدمه: تشخیص بیان پروتیین در بافت ها و سلول های عصبی برای آزمایشگاه های مدرن علوم اعصاب و آزمایشگاه هایی که رویکردهای تشخیصی را انجام می دهند ضروری است. بدین منظور، ما یک مقاله مروری جامع در مورد مراحل و چالش های وسترن بلات (WB) جمع آوری کردیم. WB نتایج کیفی خوبی برای تعیین محتوای پروتیین هدف در یک نمونه ارایه می دهد و به ویژه برای تجزیه و تحلیل پروتیین های نامحلول مفید است. این فرآیند را می توان به طور کلی به پنج مرحله تقسیم کرد: 1. استخراج پروتیین، 2. الکتروفورز، 3. انتقال غشا، 4. ایمونودیتکشن، و 5. ظهور و تجزیه و تحلیل. این فرایندها شامل انتقال الگوهای پروتیینی از ژل به غشایی با منافذ ریز است. انتقال پروتیین و به دنبال آن ایمونودیتکشن ابزاری عالی برای شناسایی بسیاری از پروتیین ها است، به ویژه پروتیین هایی که فراوانی کمتری دارند. انتقال کارآمد پروتیین ها از یک ژل به یک غشاء جامد و ایمونودیتکشن خاص تا حد زیادی به پارامترهای مختلف بستگی دارد. نتیجه گیری: برای کاهش چالش ها و افزایش آگاهی نسبت به تغییرات جدید در WB، این مقاله مروری، نمایی از روش ها، مواد و دستگاه ها در روش WB را فراهم می آورد.

0

تاکنون فیمبریه F11 فقط در سویه های بیماریزای اشریشیاکلی جدا شده از طیور، بوقلمون و انسان گزارش شده است. به منظور شناسایی این فیمبریه ابتدا 300 سویه از لاشه های طیور گوشتی مبتلا به کلی باسیلوز جداسازی و هر یک از آنها در محیط TSA چندین بار پاساژ داده شد تا فیمبریه F11 نمود یابد. در مرحله بعدی تعلیق باکتریایی تهیه شده از آنها با گلبولهای قرمز گروه خونی O انسان مجاور گردید و با افزودن قند مانوز سویه های واجد فیمبریه مقاوم به مانوز (MRHA+) مشخص شدند. سپس با استفاده از تعلیق باکتریایی و آنتی سرم اختصاصی ضد فیمبریه F11 خرگوشی، آزمایش ایمونوفلورسانس غیرمستقیم انجام شد و برای انجام روشهای ایمونودات و ایمونوبلاتینگ (وسترن بلات) ابتدا عصاره فیمبریه ای خام از هر یک از سویه ها تهیه شد و بر روی آنها آزمایشهای مذکور صورت پذیرفت و در نهایت سروتیپ سویه هایی که در هر یک از آزمایشهای واجد فیمبریه F11 بودند، تعیین شد. بدین ترتیب در روش هماتوگلوتیناسیون تنها پنج سویه (MRHA+) بودند و در روشهای ایمونوفلورسانس و ایمونودات، شش سویه واجد فیمبریه F11 تشخیص داده شدند. در ایمونوبلاتینگ نیز شش سویه واجد تحت واحد اصلی 18 کیلو دالتونی بودند که با آنتی سرم اختصاصی ضد فیمبریه F11 واکنش نشان دادند. تمامی سویه های واجد فیمبریه، متعلق به گروه سرمی O1 بودند.

سابقه و هدف: در پژوهش های مختلف نشان داده شده است که قارچ ها می توانند در افراد مستعد منجر به شکل گیری آسم آلرژیک شوند. از مهمترین قارچ های آلرژی زای شایع، می توان به آلترناریا، آسپرژیلوس ها و پنیسیلینیوم ها اشاره نمود. این مطالعه با هدف شناسایی و بررسی الگوی فراوانی باندهای آلرژی زا در قارچ های آلترناریا آلترناتا، آسپرژیلوس فومیگاتوس و پنیسیلیوم سیترینوم و همچنین مقایسه بین آنها انجام شد.مواد و روش ها: این پژوهش به صورت مقطعی-توصیفی بر روی 48 بیمار مبتلا به آسم و 22 فرد سالم به عنوان کنترل انجام شد. در ابتدا قارچ ها کشت داده شده و عصاره سلولی آنها به روش انجماد و ذوب به دست آمد. اجزای پروتئینی با روش SDS-PAGE جداسازی شده و پس از انتقال به کاغذ نیتروسلولز، ایمونوبلاتینگ بر علیه سرم بیماران آسمی و گروه کنترل انجام شد.یافته ها: پس از انجام ایمونوبلاتینگ برای آلترناریا آلترناتا 6 باند آلرژی زای 49 تا 115 کیلودالتونی، برای آسپرژیلوس فومیگاتوس 4 باند آلرژی زای 57 تا 112 کیلودالتونی و برای پنیسیلیوم سیترینوم نیز 5 باند 37 تا 127 کیلودالتونی شناسایی گردید.نتیجه گیری: در بین قارچ های مورد بررسی، آلترناریا آلترناتا بیشترین باندهای آلرژی زا را داشت. به نظر می رسد باندهای دارای وزن مولکولی بالاتر، توانایی بیشتری را در تحریک اختصاصی IgE داشته باشند.

ایمونوبلات از روشهایی است که بطور معمول برای مطالعه واکنش بین آنتی بادی و آنتی ژن مورد استفاده قرار می گیرد. واسرشته شدن برخی از پروتئین ها در ایمونوبلاتینگ می تواند تاثیر اساسی روی این واکنش بگذارد. در این پژوهش واکنش پروتئین های پیکره بروسلا آبورتوس (S19) با سرم جدا شده از گونه های انسان و بز مبتلا به بروسلوز و خرگوش ایمن شده با بروسلا با روش ایمونوبلاتینگ و کروماتوگرافی جذبی مورد بررسی قرار گرفتند.پس از کشت انبوه باکتری، استخراج آنتی ژن های پیکره بروسلا آبورتوس با زویترجنت 14-3 و لیزوزیم انجام گرفت. فراکسیون گاماگلوبولین سرم انسان، بز و خرگوش توسط آمونیوم سولفات رسوب داده شد. پروتئین های پیکره بروسلا آبورتوس از ستون کروماتوگرافی جذبی که لیگاند مورد استفاده در آن فراکسیون گاماگلوبولین انسان، بز یا خرگوش بود، عبور داده شد. برای بررسی واکنش پروتئین های باکتری با سرم ها از دو روش SDS-PAGE و ایمونوبلاتینگ استفاده شد. SDS-PAGE و ایمونوبلات پروتئین های جذب شده و جذب نشده به ستونهای کروماتوگرافی جذبی حاوی لیگاند گاماگلوبولین انسان، بز و خرگوش نشان داد که آنتی ژن های پیکره بروسلا را از نظر واکنش با آنتی بادی می توان به چهار دسته تقسیم کرد: آنتی ژن هایی که در هر دو حالت طبیعی و واسرشته با آنتی بادی واکنش می دهند.آنتی ژن هایی که در حالت طبیعی با آنتی بادی واکنش می دهند اما در حالت واسرشته واکنشی با آنتی بادی نمی دهند. آنتی ژن هایی که در حالت طبیعی با آنتی بادی واکنش نمی دهند اما در حالت واسرشته با آنتی بادی واکنش می دهند. آنتی ژن هایی که نه در حالت طبیعی و نه در حالت واسرشته با آنتی بادی واکنش نمی دهند.بطورکلی نتایج نشان داد که بررسی واکنش آنتی ژن و آنتی بادی با دو روش کروماتوگرافی جذبی و ایمونوبلاتینگ تفاوت های قابل ملاحظه ای دارند و تفسیر نتایج ایمونوبلاتینگ در خصوص بخشی از پروتئین ها چندان قابل اعتماد نیست.