وروتوکسین ها، سمومی با ساختمان زیر واحدی هستند که علاوه بر دخالت در پاتوژنز سویه های مولد، اخیرا مطالعات اولیه درمان برخی تومورهای سرطانی و رده های توموری نتایج بسیار مطلوبی داشته است. لذا شناسایی سویه های مولد سم و تولید و تخلیص آن از اهمیت خاصی برخوردار است. علی رغم طراحی روش های مختلف ژنتیکی در تشخیص سویه های مولد وروتوکسین، هنوز تشخیص سرولوژیکی با واسطه آنتی سرم پلی کلونال ضد وروتوکسین ها، روشی سریع و با اهمیت در تشخیص سویه های مولد وروتوکسین است. در این مطالعه، هدف، تخلیص وروتوکسین 1 از سویه غربال شده مولد وروتوکسین 1 است تا در مطالعات آینده در تهیه و تولید کیت تشخیصی باکتری های نامبرده استفاده شود. ابتدا سموم تولید شده از سویه های مولد وروتوکسین از مجموع پنج سویه جمع آوری شده از انستیتو پاستور ایران و آزمایشگاه رفرانس بوعلی با استفاده از کیت آگلوتیناسیون معکوس (VTEC-RPLA) غربالگری و سپس با استفاده از گلیکولیپید خالص شده از سلول های خونی گروه P تخلیص شد. سم به دست آمده از نظر میزان خلوص قابل مقایسه با سم استاندارد بود و مقدار تولید از سویه به دست آمده نیز قابل ملاحظه بود. در الکتروفورز با سیستم غیراحیا کننده، وجود باند در محدوده 70 کیلودالتونی بیانگر سم و تزریق داخل صفاقی آن در موش های Balb/c سه هفته ای، عوارضی مانند شل شدن پاهای عقبی، لاغری شدید، و اسهال آبکی را نشان داد. علاوه بر این، در اندام های مختلف موش های تزریق شده و همچنین رده های سلولی هلا و ورو آثار سیستوتوکسیکی شدید ناشی از آثار سم قابل مشاهده بود.

هدف: تعیین نقش سیکلوهگزاماید در افزایش حساسیت سلولهای Vero نسبت به سیتوتوکسین اشرشیاکلی های وروتوکسیژنیکمواد و روشها: سیکلوهگزاماید در غلظتهای متفاوت از 0.5 میکروگرم در میلی لیتر تا 16 میکروگرم در میلی لیتر در زمانهای مختلف، شامل روز قبل، همزمان، یک یا دو روز بعد از افزودن، مایع رویی سویه های استاندارد و همین طور قبل از افزودن نمونه های مدفوع (وروتوکسین مثبت به سلولهای Vero) افزوده شد.یافته ها: افزودن سیکلوهگزاماید به سلولهای Vero باعث افزایش حساسیت سلولهای Vero به میزان 4 تا 8 برابر نسبت به وروتوکسین خواهد شد. این اثر کاملا اختصاصی است و سیکلوهگزاماید در غلظت مورد اشاره به تنهایی سیتوتوکسیسیتی بر سلول Vero ندارد.نتیجه گیری: در سنجش وروتوکسین در نمونه های مدفوع، افزودن سیکلوهگزاماید در غلظت 4 تا 8 میکروگرم در میلی لیتر باعث افزایش حساسیت سلولهای Vero به وروتوکسین بدون اثر بر اختصاصی بودن سنجش می شود.

مقدمه: وروتوکسین ها سمومی با ساختمان دو بخشی هستند، که در پاتوژنز سویه های اشرشیا کولی انتروهموراژیک دخالت دارند. مطالعات اولیه درمان برخی تومورهای سرطانی و نیز بررسی اثرات سیتوتوکسیسیته این سموم روی رده های توموری در شرایط محیط کشت و حیوانات آزمایشگاهی نشان دهنده اثربخشی آنهاست. این سموم به دلیل دارا بودن گیرنده های اختصاصی بر روی رده های توموری مطالعه شده بصورت انتخابی عمل می نمایند.روش کار: در این تحقیق ابتدا سم تولید شده از 5 سویه مولد وروتوکسین بدست آمده از انستیتو پاستور ایران و آزمایشگاه رفرانس بوعلی با استفاده از کیت آگلوتیناسیون معکوس تایید، با استفاده از کروماتوگرافی جذبی تخلیص شد. در مرحله بعد رقت های مختلف سم بر روی سلول های ورو و NCF-7 تاثیر داده شد. و قابلیت زنده ماندن سلول ها و شکستگی ژنوم آنها مورد بررسی قرار گرفت.نتایج: بدست آمده نشان داد که سلول های MCF-7 حساسیت فوق العاده ای به وروتوکسین 1 دارند و مقدار 50 نانوگرم در هر میلی لیتر اثری معادل دوز سیتوتوکسیک 50 درصد CD 50% ایجاد می کند. بررسی های شکستگی ژنوم سلولی الگوی مشخصی از بروز پدیده آپوپتوزیز را نشان می دهد.بحث: نتایج این تحقیق با بررسی های قبلی در مورد سیتوتوکسیسیته وروتوکسین 1 برای بسیاری از سلول های سرطانی انسانی از جمله رده های توموری پستان همخوانی دارد و نشان می دهد که وروتوکسین 1 می تواند به عنوان یکی از مواد بالقوه سیتوتوکسیک انتخابی علیه طیف وسیعی از تومورهای انسانی مورد استفاده قرار گیرد.

اشریشیاکلی وروتوکسیژن شامل سویه هایی است که دارای ژن هایstx1 و stx2 می باشند که هر کدام نقشی در بیماریزایی باکتری E. coli دارند. این سویه ها باعث بروز اسهال خونی، سندرم همولیتیک اورمیک و ترومبوسایتوپنی پورپورا می شود. از آنجایی که احتمال وجود باکتری E. coli و سویه های وروتوکسین زا در مواد غذایی گوناگون از جمله شیر و پنیر زیاد است و به لحاظ اهمیت زیاد این سویه ها در بهداشت انسان، در همین راستا این مطالعه جهت بررسی فراوانی سویه های وروتوکسین زای اشریشیاکلی در شیر و پنیرهای غیر پاستوریزه، با روش PCR طراحی و به اجرا در آمد. در این بررسی 200 نمونه شیر غیر پاستوریزه و 80 نمونه پنیر غیر پاستوریزه مورد آزمون قرار گرفت که 38 جدایه باکتری اشریشیاکلی از نمونه های شیر غیر پاستوریزه و 14 جدایه باکتری اشریشیاکلی از نمونه های پنیر غیر پاستوریزه جدا گردید. جدایه های E. coli جدا شده از نظر وجود سروتیپ H7: O157و ژن هایstx1 ، stx2، eaeA و hlyA توسط روش PCR مورد بررسی قرار گرفتند. نتایج نشان داد که از بین 38 جدایه باکتری E. coli جدا شده از نمونه های شیر غیر پاستوریزه، 2 سروتیپ H7: O157 جدا گردید که هر دو واجد ژن های stx2، eaeA و hlyA بودند. همچنین یک جدایه غیر O157 نیـز واجد ژن stx2 شناسایی گردید. هیچ یک از جدایه ها واجد ژن stx1 نبودند. از بین 14 جدایه باکتری E. coli جدا شده از نمونه های پنیر غیر پاستوریزه، هیچ کدام واجد ژن های مذکور نبودند و سروتیپ H7: O157نیز جدا نگردید.

زمینه و اهداف: در سالهای اخیر از متابولیتهای مختلف میکروبی از جمله انتروتوکسینها، پروتئین های باکتریال، سموم نو ترکیب و درمان ترکیبی به دلیل محدودیت درمانهای رایج سرطان زا جمله شیمی درمانی و پرتودرمانی برای درمان انواع سرطانها استفاده شده است. وروتوکسینها سمومی هستند، که از سالها پیش اثر ضد توموری آنها شناخته شده است. این سموم توسط برخی سویه های اشرشیاکولی تولید می شوند. لذا در این تحقیق با توجه به اثرات ضد توموری وروتوکسین 1 اثر همزمان این ترکیب را با منوفسفوریل لیپید Monophosphory Lipid A (MPL) (یکی از مشتقات غیر سمی لیپوپلی ساکارید باکتریها را که دارای خاصیت ادجوانتی و نکروز تومور است)، بر روی فیبروسارکومای ایجاد شده در موش آزمایشگاهی بررسی نمودیم.روش بررسی: برای آزمایشهای حیوانی ابتدا وروتوکسین 1 بصورت رقت سریال دو برابر در گروههای 6 تایی موش آزمایشگاهی بصورت داخل صفاقی تزریق و تا 7 روز تعداد موشهای مرده در رقتهای مختلف محاسبه شده، و مقدار 50 درصد کشنده سم با روش Reed & Munch در موشهای Balb/c تعیین شد. پس از آن با تزریق سلولهای WEHI- 164 در 16 موش (به تعداد 3 میلیون سلول در هر موش) به صورت زیر جلدی تومورهای قابل مشاهده ایجاد شده و به چهار گروه 4 تایی تقسیم شدند. به گروه اول 25 نانوگرم وروتوکسین 1، گروه دوم 50 میکروگرم منوفسفوریل لیپید A، گروه سوم 25 نانوگرم ورتوکسین 1 و 25 میکروگرم منوفسفوریل لیپید A بصورت داخل توموری تزریق نمودیم. در گروه چهارم به عنوان شاهد نیز وروتوکسین غیرفعال شده با حرارت را تزریق کردیم. اندازه تومورها روزانه با محاسبه طول و عرض آنها با کولیس و فرمول 2/2عرض×طول محاسبه شد. با استفاده از آنالیز واریانس تفاوتهای بین گروههای مختلف ارزیابی شد.یافته ها: وروتوکسین 1 مشابه سلول استاندارد ورو اثرات سیتوتوکسیکی بر رده سلولی WEHI-164 نشان داد. تاثیر همزمان آن با منوفسفوریل لیپید A سبب حذف کامل تومورهای فیبروسارکومای بدخیم ایجاد شده در موشهای آزمایشگاهی شد. 100 نانوگرم وروتوکسین 1 به عنوان دز کشنده 50 درصد در موش آزمایشگاهی تعیین شد. تومورهای تزریق شده با منوفسفوریل لیپید A در مقایسه با گروه کنترل منفی (درمان نشده) بدون تغییر حجم و یا افزایش کمی در حجم تومورها نشان دادند. این اثر از نظر آماری معنی دار نبود. در حالی که تومورهای کنترل منفی (درمان نشده)، پس از کاهش وزن شدید سبب مرگ موشها شدند. موشهای گروه کنترل حداکثر در یک ماده پس از تزریق از بین می رفتند.نتیجه گیری: نتایج این مطالعه نشان می دهد که اگر چه اثر وروتوکسین 1 به تنهایی بر روی بسیاری از تومورهای انسانی ثابت شده است. لیکن به دلیل اثر هم افزایی با منوفسفوریل لیپید A و حذف کامل تومورهای بدخیم فیبروسارکوما، از توام آنها می توان در درمان فیبروسارکوما و سایر بیماریهای بدخیم مشابه استفاده نمود.

سابقه و هدف: اغلب سویه های اشریشیا کلی O157:H7 توانایی اتصال محکم به سلول های ورو و تولید شیگا توکسین را دارند. این مطالعه با هدف توسعه یک مدل آزمایشگاهی پروبیوتیکی برای محافظت در برابر اشریشیا کلیO157:H7  انجام شد.مواد و روش ها: پژوهش حاضر به صورت تجربی بر روی سویه های پروبیوتیک بیفیدوباکتریوم و سویه های شیگاتوکسینوژن اشریشیا کلی O157:H7 در سلول های تک لایه ورو انجام شد. برای این منظور سویه های پروبیوتیک در محیط MRS  کشت و سپس به چاهک های رده سلولی ورو اضافه گردیدند. پس از گرماگذاری، سلول های خالص شناسایی شده واجد ژن های stx1، stx2، مخلوط هر دو و نیز سوسپانسیون کشت اشریشیا کلی O157:H7 به هر چاهک اضافه و نتایج CPE پس از 24 ساعت گرماگذاری در انکوباتور CO2 به وسیله میکروسکوپ معکوس بررسی شد.یافته ها: بر اساس مقدار شیگاتوکسین و اشریشیا کلی O157:H7 استفاده شده، سلول های ورو پیش تیمار شده با پروبیوتیک ها اثر متفاوتی نشان دادند. شیگاتوکسین و اشریشیا کلی O157:H7 به تنهایی سبب تخریب زیاد سلول شدند. اما پیش تیمار پروبیوتیکی موجب کاهش قابل ملاحظه تخریب سلول های آلوده به اشریشیا کلیO157:H7  گردید. در مقایسه با سلول های کنترل با توجه به میزان پروبیوتیک مورد استفاده، 80 تا 100 درصد سلول ها سالم باقی ماندند.نتیجه گیری: نتایج این پژوهش نشان داد که بیفیدوباکتریوم ها و محلول روماند حاصل از رشد آن ها موجب کاهش تخریب سلول های ورو در حضور شیگاتوکسین و اشریشیا کلی O157:H7 می شوند. بنابراین امکان استفاده ازآنها در صنایع غذایی به عنوان یک مدل واکسن زنده در پیشگیری و درمان عفونت ها می تواند وجود داشته باشد.

لطفا برای مشاهده چکیده به متن کامل (PDF) مراجعه فرمایید.

هدف: وروتوکسین یکی از سموم خانواده توکسین های شیگا است. این خانواده شامل توکسین های پروتئینی AB، یعنی توکسین هایی با یک بخش فعال آنزیماتیک (A) و یک بخش باند شونده به سطح سلول (B) است. سلول هایی که دارای جایگاه اتصالی یعنی گیرنده Gb3 باشند به آثار توکسیک توکسین پاسخ می دهد. نشان داده شده است که وروتوکسین نوع 1 بر انواعی از سلول های توموری که گیرنده Gb3 را دارا هستند، اثر آپوپتوتیک داشته و به صورت انتخابی عمل می کند. مطالعات زیادی که روی آثار ضد توموری و ضد رگ زایی این سم روی رده های سلولی سرطانی مختلف در شرایط آزمایشگاهی و حیوانات آزمایشگاهی انجام گرفته نشان دهنده اثر بخشی آن ها است.هدف از این پژوهش مقایسه آثار سمیت سلولی وروتوکسین نوع 1 انتروهموراژیک اشرشیاکلی روی دو رده سلولی ورو (استاندارد طلایی برای بررسی آثار سمیت سلولی وروتوکسین) و راجی (رده سلولی به دست آمده از کشت سلول های لنفوبلاستوئید بیماران مبتلا به لنفوم بورکیت انسانی) است.مواد و روش ها: پس از تهیه مواد، سویه توکسین زا و رده های سلولی، سویه مورد نظر کشت داده شد و توکسین زایی آن با استفاده از روش آگلوتیناسیون پاسیو معکوس تایید شد. وروتوکسین 1 با استفاده از روش کروماتوگرافی جذبی تخلیص شد و آن گاه اثر سمیت سلولی آن بر روی دو رده سلولی ورو و راجی با استفاده از آزمون MTT بررسی و اندازه گیری شد.نتایج: یافته ها نشان داد که وروتوکسین نوع 1 روی سلول های راجی نیز مانند سلول های ورو اثر سرکوب گری بالایی دارد و این اثر وابسته به غلظت توکسین است و با رقیق شدن سم اثر سرکوب گری آن کاهش می یابد.بررسی آماری نشان داد که خاصیت سرکوب گری سم روی سلول های راجی در رقت های 1:4 تا 1:128 نسبت به خاصیت سرکوب گری سم روی سلول های ورو دارای اختلاف معنی داری است و این اثر روی سلول های ورو بیشتر از سلول های راجی است (P<0.05). اما این توکسین در رقت های بالاتر قادر به سرکوب معنی دار نبوده است.نتیجه گیری: نتایج به دست آمده نشان داد که وروتوکسین نوع 1 روی سلول های راجی مانند سلول های ورو اثر سرکوب گری بالایی دارد و این اثر بر سلول های ورو بیشتر از سلول های راجی است (P<0.05).

اشریشیاکلی انتروهموراژیک (EHEC) به سروتیپ های مختلف O تعلق داشته و با سندرم های اورمی همولیتیک (HUS) و کولیت هموراژیک (HC) ارتباط دارد. به منظور جداسازی اشریشیاکلی انتروهموراژیک و سنجش وروتوکسین (VT)؛1557 نمونه مدفوع جمع آوری گردید. برای جداسازی اولیه EHEC از محیط سوربیتول مکانکی آگار و برای تشخیص قطعی از تست های بیوشیمیایی استفاده گردید. برای استخراج وروتوکسین از روش کارمالی با استفاده از پلی میکسین B و برای سنجش وروتوکسین از سلول Vero استفاده گردید. در طی این مطالعه از 1557 نمونه مدفوع 26 مورد اشریشیاکلی انتروهموراژیک جدا گردید و هر 26 ایزوله بر روی سلولها Vero اثرات سیتوپاتیک نشان دادند. اختلاف معنی داری بین میزان جداسازی EHEC و اسهال در نواحی روستایی مشاهده نشد و اکثر افرادی که حامل EHEC بودند افراد سالم و بدون علامت اسهالی بودند اما در نواحی شهری این اختلاف معنی دار بود (P=0.001). در سنجش نوع وروتوکسین از 26 ایزوله جدا شده در 18 ایزوله (69.2%) وروتوکسین شماره 1 (VT1) در 7 ایزوله (26.9%) وروتوکسین شماره 2 (VT2) و در یک ایزوله (3.9%) هر دو نوع وروتوکسین مشاهده گردید. در آزمون گروه بندی سرمی در میان 26 ایزوله یک مورد (3.9%) با آنتی سرم H7:157 واکنش اگلوتیناسیون مشاهده گردید و نتایج این مطالعه نشان می دهد که EHEC در ایلام شایع بوده و اکثر سویه ها تولید کننده وروتوکسین شماره 1 هستند، همچنین سروتیپ H7:157 از نظر اپیدمیولوژی شایع ترین سروتیپ نیست.

مقدمه: وروتوکسین ها سمومی با ساختمان دو بخشی هستند که در پاتوژنز سویه های اشرشیا کولی انتروهموراژیک دخالت دارند. مطالعات اولیه درمان برخی تومورهای سرطانی و نیز بررسی اثر سیتوتوکسیسیته این سموم روی رده های توموری در شرایط محیط کشت (In Vitro) و حیوانات آزمایشگاهی نشان دهنده اثر بخشی آنهاست. این سموم به دلیل دارا بودن گیرنده های اختصاصی بر روی رده های توموری مطالعه شده به صورت انتخابی عمل می نمایند. هدف از این تحقیق بررسی سیتوتوکسیسیته وروتوکسین 1 تلخیص شده از سویه مولد وروتوکسین اشریشیا کولی توام با منوفسفوریل لیپید (MPL)A بر روی رده سلولی تومور پستانی انسان به نام MCF-7 بود. مواد و روشها: در این تحقیق ابتدا وروتوکسین 1 تولید شده از 5 سویه مولد وروتوکسین به دست آمده از انستیتو پاستور ایران و آزمایشگاه مرجع بو علی با استفاده از کیت آگلوتیناسیون معکوس1(VTEC-RPLA) تایید و با استفاده از کروماتوگرافی جذبی تخلیص شد. در مرحله بعد رقت های مختلف وروتوکسین 1 و MPL به صورت توام و یا جداگانه بر روی رده سلولی MCF-7 اضافه شد و قابلیت زنده ماندن سلول ها (Viability) با استفاده از تریپان بلو و شکستگی ژنوم آنها با الکتروفورز آگارز بررسی گردید. یافته ها: مطالعات ما نشان داد که سلول های MCF-7 مطابق با تحقیقات قبلی حساسیت فوق العاده ای به وروتوکسین 1 دارند و مقدار 33 نانوگرم در هر میلی لیتر اثری معادل دوز سیتوتوکسیک 50 درصد CD50% ایجاد می کند. بررسی های شکستگی ژنوم سلولی الگوی مشخصی از بروز پدیده آپوپتوزیز را نشان می دهد. در حالی که MPL به تنهایی ماده ای غیر سمی است؛ ولی استفاده توام آن با وروتوکسین 1 اثرات سمی آن را تشدید می کند. نتیجه گیری: اگرچه اثرات ضد توموری وروتوکسین 1 از سال ها قبل روشن شده است؛ ولی کشف و شناسایی عوامل مختلف تشدید کننده اثر سیتوتوکسیک مواد ضد تومورها نیز مورد توجه محافل علمی است MPLیکی از متابولیت های میکروبی است که اثر سینرژیستی آن با وروتوکسین 1 در مرگ سلول های توموری پستان برای اولین بار در این تحقیق مورد بررسی شده است.