بیماری پوسیدگی طوقه برنج یکی از بیماری های بذر زاد برنج است که از خزانه تا شالیزار روی برنج دیده می شود. تولید گیاهچه های طویل و غیر طبیعی از بذور آلوده در اثر جیبرلیک اسید در خزانه و مزرعه از مهمترین علائم این بیماری می باشد. در این تحقیق، اثر جیبرلیک اسید تولید شده توسط GIBBERELLA FUJIKUROI روی افزایش رشد ساقه چه و ریشه چه و مرگ و میر بذور رقم هاشمی ارزیابی شد. بذور رقم هاشمی به وسیله سوسپانسیون کنیدیومی جدایه های G. FUJIKUROI سواسازی شده از گیاهچه های آلوده از مزارع برنج استان گیلان مایه زنی گردید. میزان افزایش رشد با اندازه گیری طول ساقه چه، ریشه چه و تعداد بذر مرده هر پنج روز یکبار و میزان جیبرلیک اسید تولید شده توسط جدایه های G. FUJIKUROI با استفاده از دستگاه کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) تعیین شد. نتایج تعیین کمّی جیبرلیک اسید نشان داد که تمامی جدایه های مورد بررسی توانایی تولید این هورمون را داشتند. همبستگی معنی داری بین میزان هورمون جیبرلین استخراج شده از بیمارگر و طول ریشه چه و ساقه چه حاصل از جوانه زنی بذور هاشمی مایه زنی شده و نیز تعداد بذر مرده مشاهده نشد.

پوسیدگی طوقه ی برنج از مهم ترین بیماری های این گیاه در مناطق برنج کاری است. قدکشیدگی از علائم بارز این بیماری است که در اثر تولید هورمون جیبرلین توسط بیمارگر ظاهر می شود. این تحقیق به منظور شناسایی مجدد گونه های بیمارگر باکانه، ترکیب جمعیتی گونه ای بیمارگر، شدت بیماری زایی، تولید هورمون جیبرلین و ارتباط دو صفت اخیر با جمع آوری 50 نمونه ی گیاهی و سوا سازی 23 جدایه از بیمارگر انجام شد. تعیین شدت بیماری زایی به روش مایه زنی ساقه ی رقم گوهر در مرحله ی گیاهچه ای صورت گرفت. نتایج شناسایی جدایه ها منجر به تشخیص گونه هایFusarium FUJIKUROI و Fusarium verticillioides به ترتیب با ترکیب جمعیتی 4/88 و 6/11 درصد شد. نتایج آزمون بیماری زایی نشان داد، مایه زنی باعث ایجاد آلودگی در تمام گیاهان می شود، هر چند جدایه ها از جهت شدت بیماری زایی در میزبان متفاوت بودند. تعیین میزان جیبرلین به روش های اسپکتروفتومتری(طیف سنج نوری) و HPLC نشان داد، همه ی جدایه ها قادر به تولید جیبرلین می باشند ولی میزان آن در جمعیت مورد مطالعه متفاوت بود. آنالیز داده ها مشخص کرد که بین شاخص میزان تولید جیبرلین در بیمارگر و درصد افزایش ارتفاع ساقه (شدت بیماری زایی) در گیاه از لحاظ آماری ارتباط معنی داری وجود ندارد. احتمالاً حضور بیمارگر در گیاه و تأثیر قدرت بیماری زایی آن بیشتر و یا سریع تر از تأثیر جیبرلین در گیاه واقع شده است. این موضوع منجر به عدم درک رابطه ی بین میزان جیبرلین تولید و شدت بیماری زایی بیمارگر شد.

از بوته های برنج آلوده به بیماری پوسیدگی طوقه در مناطق مختلف استان مازندران شصت و یک جدایه فوزاریوم متعلق به بخش لایزئولا بدست آمد. تمامی این جدایه ها در آزمون های بیماری زایی علایم عمومی پوسیدگی طوقه را روی گیاهچه های برنج ایجاد کردند. پس از شناسایی جدایه ها بر اساس خصوصیات مورفولوژیک و به منظور تعیین جمعیت و تیپ های آمیزشی، تمامی این جدایه ها به عنوان والد نر با جدایه های آزمون گر استاندارد هر دو تیپ آمیزشی از سه جمعیت آمیزشی A، C و D قارچ GIBBERELLA FUJIKUROI تلاقی داده شدند. بر این اساس 18.03% (11 جدایه) جدایه ها بارور بودند و تمامی این 11 جدایه با جدایه های آزمون گر استاندارد MATD-1 تولید پریتسیوم کردند و به عنوان G.FUJIKUROI MATD-2 شناسایی شدند. هیچ کدام از جدایه های Fusarium FUJIKUROI و F. verticillioides در این مطالعه بارور نبودند. این اولین گزارش از وجود یک جمعیت آمیزشی یا گونه بیولوژیک قارچ G. FUJIKUROI در استان مازندران می باشد.

به منظور مطالعه باروری جنسی و تعیین تیپ های آمیزشی GIBBERELLA FUJIKUROI، عامل پوسیدگی طوقه برنج، طی سال 1383 نمونه برداری از مزارع برنج آلوده نقاط مختلف استان گیلان صورت گرفت. یکصد و سی و سه جدایه تک اسپور از رقم خزر و 9 جدایه از ارقام محلی بدست آمدند. شناسایی مرفولوژیکی قارچ با استفاده از کلیدهای معتبر با کشت جدایه ها روی محیط غذایی SNA انجام شد. به منظور مطالعه باروری جنسی، تلاقی های زیادی بین جدایه های محلی روی محیط غذایی هویج آگار انجام شد و 4 جفت از جدایه های محلی تلاقی باروری داشتند. شصت جدایه نیز با جدایه های استاندارد سه جمعیت آمیزشیA ، C و D در شش تیپ آمیزشی MATA-1، MATA-2، MATC-1، MATC-2، MATD-1 و MATD-2 تلاقی داده شدند. به ترتیب 23%، 17% و 38% جدایه های مزرعه ای متعلق به جمعیت های آمیزشی A، C و D بودند. همه جدایه های مزرعه ای که در شرایط آزمایشگاهی با یکدیگر تلاقی بارور داشتند، در جمعیت آمیزشی D قرار گرفتند. آسکوسپورهایی که بعد از فصل برداشت از پریتسیوم های تشکیل شده روی ساقه های مرده برنج جدا شده بودند، نیز در جمعیت آمیزشی D قرار گرفتند. به منظور اثبات بیماریزایی، 142 جدایه روی رقم خزر مایه زنی شدند که 9 جدایه قادر به ایجاد بیماری نبودند. در این تحقیق معلوم شد که سه جمعیت آمیزشی (Fusarium verticillioides) A، جمعیت آمیزشی (Fusarium FUJIKUROI) C و جمعیت آمیزشی (Fusarium proliferatum) D به عنوان عامل پوسیدگی طوقه برنج در گیلان وجود دارد. 

بیماری پوسیدگی طوقه برنج(Sawada) GIBBERELLA FUJIKUROI یکی از بیماری های بذر زاد برنج می باشد که از علائم بارز آن ایجاد گیاهچه های بلند، باریک و رنگ پریده از بذور آلوده و تولید هورمون جیبرلیک اسید توسط جدایه های بیمارگر در آنها می باشد. تعیین شدت بیماری زایی قارچ G. FUJIKUROI و ارتباط آن با میزان کمّی جیبرلیک اسید تولید شده توسط قارچ در برنج رقم سپیدرود از اهداف تحقیق حاضر می باشد. به این منظور نمونه برداری از گیاهچه های آلوده، جداسازی و خالص سازی قارچ انجام شد. هر یک از جدایه ها در محیط اختصاصی تولید جیبرلیک اسید کشت و مقدار کمّی هورمون تولید شده توسط جدایه های بیمارگر بوسیله دستگاه HPLC تعیین شد. سوسپانسیون بیمارگر در مرحله انتهایی آبستنی و ابتدای مرحله ظهور خوشه در ساقه رقم سپیدرود تزریق و علائم بیماری بررسی شد. طبق نتایج این تحقیق ارتباط معنا داری بین شدت بیماری زایی قارچ G. FUJIKUROI و میزان کمّی جیبرلیک اسید تولید شده توسط آن در برنج رقم سپیدرود مشاهده نشد.

به منظور مطالعه ساختار جمعیت گونه کمپلکس GIBBERELLA FUJIKUROI، عامل پوسیدگی طوقه برنج، نمونه برداری از مزارع نقاط مختلف استان گیلان در سال 1383 صورت گرفت. از بین 41 جدایه به دست آمده از ارقام مختلف، به غیر از سه جدایه، بقیه دارای زنجیره میکروکنیدیوم بودند. برای مطالعه باروری جنسی و تعیین جمعیت و تیپ آمیزشی جدایه ها، هر یک از آنها با شش جدایه ماده بارور نماینده استاندارد از سه جمعیت آمیزشی A،C  و D روی محیط غذایی هویج آگار در آزمایشگاه تلاقی داده شدند. به ازای هر جمعیت آمیزشی دو جدایه نماینده از دو تیپ آمیزشی مخالف شامل MATA-1 و MATA-2 برای جمعیت آمیزشی A،MATC-2 و MATC-1  برای جمعیت آمیزشی C و MATD-1 و MATD-2 برای جمعیت آمیزشی D مورد استفاده قرار گرفتند. در نتیجه، ده جدایه در جمعیت آمیزشی A (Fusarium verticillioides)، دو جدایه در جمیعت آمیزشی (F. FUJIKUROI) C و 29 جدایه در جمعیت آمیزشی (F. proliferatum) D گروه بندی شدند. تمام جدایه های F. verticillioides متعلق به تیپ آمیزشی MATA-1 و تمام جدایه های F. FUJIKUROI متعلق به تیپ آمیزشی MATC-1 بودند. در حالی که، هر دو تیپ آمیزشی MATD-1 و MATD-2 برای جدایه های F. proliferatum شناسایی شدند. به علت وجود هر دو تیپ آمیزشی در جدایه های جمعیت آمیزشی D، امکان تلاقی بین آنها مطالعه گردید که از 36 تلاقی تنها دو تلاقی منجر به تشکیل پریتسیوم واجد آسک و آسکوسپور شدند. در آزمون سازگاری رویشی با استفاده از جهش یافته های nit نیز مشخص شد که ده جدایه F. verticillioides در نه گروه سازگاری رویشی، دو جدایه F. FUJIKUROI هر کدام در یک گروه سازگاری رویشی جداگانه و 29 جدایهF. proliferatum  نیز در بیست گروه سازگاری رویشی قرار گرفتند. تلاقی جدایه های متعلق به سه جمعیت آمیزشی با هم نیز منجر به تشکیل هتروکاریون نگردید. آزمون بیماری زایی 41 جدایه روی رقم خزر انجام گردید و همه جدایه ها نشانه پوسیدگی طوقه همراه با کلنی های سفید رنگ روی ساقه ها را ایجاد کردند. در این تحقیق معلوم شد که جمعیت های آمیزشی A،C  و D از گونه کمپلکس G. FUJIKUROI در گیلان وجود دارند که در بین آنها جمعیت آمیزشی D غالب است. همچنین بر اساس آزمون شناسایی گروه های سازگاری رویشی تنوع زیادی در دو جمعیت آمیزشی A و D مشاهده شد.

به منظور بررسی وضعیت باروری جنسی و تیپ آمیزشی گونه های GIBBERELLA moniliformis و G. intermedia، عوامل پوسیدگی طوقه یا باکانه برنج و پوسیدگی خوشه و ساقه ذرت از گونه مرکب G. FUJIKUROI به کمک واکنش زنجیره ای پلیمراز، از 128 جدایه تک اسپور بدست آمده از مزارع برنج استان های گیلان و مازندران و مزارع ذرت استان های مختلف ایران شامل 16 جدایه G. moniliformis از برنج و 54 جدایه از ذرت، 28 جدایه G. intermedia از برنج و 30 جدایه از ذرت استفاده شد. از بین این جدایه ها 30 جدایه G. intermedia از ذرت، 12 جدایه از برنج و پنج جدایه G. moniliformis از برنج در مطالعه وضعیت باروری جنسی به کمک جدایه های آزمایشگر استاندارد روی محیط غذایی هویج آگار استفاده گردید. جهت تعیین تیپ آمیزشی و وضعیت باروری جدایه ها از روش multiplex PCR و دو جفت آغازگر اختصاصی به نام های GFmat1a،GFmat1b  و Gfmat2c،Gfmat2d  استفاده شد و وجود و فراوانی هر یک از ایدیومورف های تیپ آمیزشی در تمام جدایه ها ردیابی و تعیین گردید. از مجموع 68 جدایه G. moniliformis از برنج و ذرت، 47 جدایه (69 درصد) متعلق به MAT-1 و 21 جدایه (31 درصد) متعلق به MAT-2 بودند. از مجموع 53 جدایه G. intermedia از برنج و ذرت، 33 جدایه (62 درصد) متعلق به تیپ آمیزشی MAT-1 و 20 جدایه (38 درصد) متعلق به تیپ آمیزشی MAT-2 بودند. از 42 جدایه G. intermedia حاصل از برنج و ذرت که در تلاقی با جدایه های استاندارد استفاده گردیدند، 26 جدایه (62 درصد) دارای تیپ آمیزشی MAT-1 و 16 جدایه (38 درصد) دارای تیپ آمیزشی MAT-2 بودند. نتایج حاصل از تلاقی جدایه های مورد مطالعه با جدایه های استاندارد با نتایج حاصل از واکنش زنجیره ای پلیمراز مشابه بود. همچنین جدایه های مزرعه ای دارای تیپ آمیزشی مخالف (سازگار) با یکدیگر تلاقی داده شدند و پریتسیومی مشاهده نشد که نشان دهنده نربارور بودن جدایه ها می باشد. برای بروز نوترکیبی جنسی و تنوع ژنتیکی درون یک جمعیت وجود هر دو آلل از تیپ های آمیزشی مختلف با فراوانی مناسب و اینکه حداقل یکی از دو والد ماده بارور یا هرمافرودیت باشد، ضروری می باشد. در این تحقیق، هر دو تیپ آمیزشی در جمعیت هر دو گونه قارچ شناسایی شدند که البته فراوانی تیپ آمیزشی MAT-1 نسبتا بیشتر بود ولی با توجه به کم بودن افراد ماده بارور در جمعیت، بروز تنوع ژنتیکی در جمعیت قارچ های G. moniliformis و G. intermedia بدست آمده از برنج و ذرت می تواند از طریق مکانیسم های دیگر تغییرپذیری باشد.

در جریان بازدید از شالیزارهای برنج استان های فارس و خوزستان در مرحله ی سفت شدن دانه، 42 نمونه بذر گرد آوری شد. برای جداسازیFusariumاز نمونه ها، بذرها روی محیط غذایی اختصاصی فوزاریوم (Pepton-PCNB-Agar, PPA) به دو روش ضدعفونی با محلول هیپوکلریت سدیم 1درصد و بدون ضدعفونی کشت و در انکوباتور (اتاقک رشد) با دمای 1± 25 درجه ی سلسیوس و نور متناوب (روشنایی و تاریکی) نگهداری شدند. 26 جدایه بر اساس ویژگی های ریخت شناختی روی محیط های کشت PDA، CLAو SNAو استفاده از منابع معتبر شناسایی شد. همچنین ارزیابی فیلوژنیک (تبارزایی) 18 و 6 جدایه ی منتخب بر اساس توالی ناحیه ی ژنی TEF1-α و توالی نوکلئوتیدی ناحیه ی ITSانجام گرفت. نتایج نشان داد، جدایه-های Fusariumمورد بررسی، متعلق به دو گونه ی مرکب FIESC(Fusarium incarnatum-equiseti species complex) و GFSC(GIBBERELLAFUJIKUROI species complex)، به ترتیب با فراوانی50 و 46 درصد بودند. F. FUJIKUROIدر استان فارس و F. semitectumدر استان خوزستان بیشترین فراوانی را داشتند. در این تحقیق دو گونه ی F. FUJIKUROIو F. andiyaziمتعلق به گونه ی مرکب GFSCبر اساس توالی ژن TEF1-α ، در دو کلاد مجزا تفکیک شدند. توالی یابی ناحیه ی ژنی TEF1-α برای تفکیک و شناسایی اعضای گونه ی مرکب GFSCمفید است اما توالی ناحیه ی ITSنتوانست این گونه ها را شناسایی و از همدیگر تفکیک کند. تک جدایه ی F. merismoidesکه بر اساس ویژگی های ریخت شناختی شناسایی شد، توسط توالی ژن TEF1-α شناسایی نشد اما در درخت فیلوژنیک رسم شده بر اساس توالی ناحیه ی ITSاز جنس Fusariumتفکیک و به جنسFusicollaو گونه ی F. acetilereaمنتقل شد.

یک صد و دو جدایه میکروارگانیسم از 85 نمونه خاک شالیزارهای نقاط مختلف استان گیلان سواسازی شدند. پس از بررسی آثار آنتاگونیستی آنها درمقابل قارچ عامل بیماری پوسیدگی طوقه برنج GIBBERELLA FUJIKUROI در محیط غذایی PDA ، بیست و یک جدایه برای آغشتن بذر در محیط مرطوب انتخاب شدند. هفت جدایه که تاثیر خوبی در کاهش تشکیل پرگنه بیمار گر روی بذر و گیاهچه داشتند، اثرشان در کنترل بیماری در یک آزمایش گلخانه ای و به صورت اسپلیت پلات بررسی شدند. این جدایه ها شامل Bacillus subtilis, B.circulans, Bacillus sp., Trichoderma harzianum, T.virens, (دو جدایه) و F.23) شناسایی نشده بودند. نتایج نشان داد که همه آنتاگونیستها در مقایسه با شاهد در کاهش بیماری در خاک سترون موثر بودند ولی تاثیر کلی B.circulans,T.harzianum,T.virens بهتر از بقیه آنتاگونیستها و کمتر از تیمار قارچ کش (تیوفانات متیل تیرام، 2 گرم در لیتر) بود. همچنین مشخص شد که آغشتن بذر با آنتاگونیست ها قبل از آلوده سازی به بیمار تاثیر معنی داری در کاهش آلودگی نسبت به تاخر به کار گیری آنتاگونیست ها بعد از آلوده سازی به بیمار گر داشته است.

این پژوهش با هدف، جداسازی و شناسایی قارچ های اندوفیت برنج به منظور کاربرد آن ها به عنوان جایگزین مؤثر و بی خطر به جای قارچکش های شیمیایی برای کنترل بیماری پوسیدگی طوقه با عامل Fusarium FUJIKUROI انجام شد. قارچ های اندوفیت، از برگ، ساقه، غلاف و ریشه بوته های برنج شالیزارهای استان مازندران و گیلان جداسازی شد. جدایه های قارچی به دست آمده، ابتدا در آزمون کشت متقابل علیه سویه پُرآزار F. FUJIKUROI F257غربال شده و سپس سویه های مؤثر برای آزمون گلخانه انتخاب شدند. بذور برنج با جدایه های منتخب اندوفیت، تیمار و درصد وقوع بیماری در نشاها و نیز شاخص های رشد برنج تعیین شدند. کمترین میزان وقوع مرگ گیاهچه در نشاهای برنج تحت تیمار قارچ های اندوفیت NR-R688 Chaetomium globosumو C. globosum NR-SH321 با دو درصد (4/97 درصد کنترل وقوع بیماری)، NR-L243 Penicillium sp. و Fusarium sp. NR-L645 با شش درصد (3/92 درصد کنترل وقوع بیماری) مشاهده شد. همچنین، این چهار سویه باعث افزایش معنی دار شاخص های رشد گیاه برنج نسبت به گیاهان شاهد شد. نتایج این تحقیق نشان داد که قارچ های اندوفیت برنج می توانند به عنوان عوامل کنترل زیستی بیماری پوسیدگی طوقه و افزاینده رشد برنج با هدف کاربردی نمودن آن ها در تحقیقات آتی مورد توجه قرار گیرد.