برای اطلاع از آخرین مقالات علمی و اخبار کرونا(COVID-19) کلیک کنید

مشخصات

عنوان:

جداسازی باکتری های نمک دوست تولید کننده پروتئاز قلیایی و بررسی اثر عوامل مختلف بر تولید و تخلیص آزمایشگاهی آنزیم



گروه تخصصی:  علوم پایه

سازمان مجری:  واحد تهران 

گروه پژوهشی: علوم پایه

پژوهشگران: 
تاریخ خاتمه:  پاییز 1388

کارفرما: 

خروجی طرح: 
 
تلفن: 66495417-021

نشانی سازمان مجری: تهران، خیابان انقلاب، خیابان 16آذر، سازمان مرکزی دانشگاه تهران، طبقه پنجم، صندوق پستی: 186-13145
 

چکیده:

پروتئازها یکی از مهمترین گروه های آنزیم های صنعتی به شمار می روند. پروتئازهای جدا شده از موجودات نمک دوست دارای ویژگی هایی خاصی هستند که آنها را برای کاربرد های بیوتکنولوژیک جذاب می سازند. از میان 82 سویه باکتری نمک دوست نسبی جدا شده از نواحی مختلف در ایران، دو سویه MA-2 و AF-2004 بعنوان بهترین تولید کننده های آنزیم پروتئاز انتخاب شدند و مورد مطالعه قرار گرفتند. بر طبق ویژگی های فنوتیپی و آنالیز توالی 16S rRNA سویه های MA-2 و AF-2004 به ترتیب در جنس هایHalobacillus  و Salinivibrio طبقه بندی شدند.
تولید آنزیم پروتئاز در باکتری
Halobacillus سویه MA-2 تحت شرایط شوری بالا در محیط پایه حاوی پپتون، عصاره گوشت، مالتوز و نمک کلرید سدیم در مرحله رشد رکود باکتری مورد بررسی قرار گرفت. اثر دماهای مختلف،pH  اولیه و منابع مختلف غذایی بر تولید آنزیم پروتئاز نشان داد که حداکثر تولید آنزیم در دمای 34 درجه سانتی گراد،pH  بین 8 تا 8.5 و در حضور ژلاتین صورت می گیرد. جایگزینی نمک کلرید سدیم با غلظت های مختلف نمک نیترات سدیم در محیط پایه تولید آنزیم پروتئاز را افزایش داد. پروتئاز ترشحی با استفده از روش ترکیبی رسوب گذاری با استون و کروماتوگرافی تعویض یونی Q سفاروز با %68 بازیافت تخلیص گشت. آنزیم ساختار تک واحدی داشته و وزن مولکولی آن در ژل الکتروفورز 36 کیلودالتون تخمین زده شد. حداکثر فعالیت کازینولیتیکی آنزیم در دمای 50 درجه سانتی گراد، 9pH و 0.5 مولار کلرید سدیم دیده شد اگر چه در نمک های بالاتر (حداکثر تا 3 مولار) فعالیت هنوز باقی ماند. فعالیت آنزیم شدیدا بوسیله PMSF،Pefabloc SC  و EDTA مهار شده که نشان می دهد احتمالا آنزیم متعلق به زیر کلاس سرین متالوپروتئاز است. این یافته ها پیشنهاد می کند که پروتئاز ترشح شده بوسیله  Halobacillus sp. Strain MA-2 چون ویژگی قلیا دوستی و نمک دوستی دارد توانمندی بالقوه برای کار در زمینه بیوتکنولوژی دارد.
یک پروتئاز خارج سلولی بوسیله  باکتری
Salinivibrio sp.strain AF-2004 در محیط پایه دارای پپتون، عصاره گوشت، گلوکز و نمک کلرید سدیم تولید گشت. این سویه قادر به تولید آنزیم پروتئاز در حضور نمکهای سدیم کلراید، سدیم سولفات، سدیم نیترات، پتاسیم کلراید، سدیم استات و سدیم سیترات بود. حداکثر تولید آنزیم پروتئاز در حضور %7.5 تا %10 سدیم سولفات و %3 سدیم استات مشاهده شد. منابع کربنی مختلف شامل گلوکزف لاکتوز، کازئین و پپتون توانایی القا تولید آنزیم را داشتند. بهینه pH، دما و هوادهی برای تولید آنزیم به ترتیب 9، 32 درجه سانتی گراد و 220rpm بود. تولید آنزیم منطبق بر رشد باکتری بود و حداکثر تولید آن در اواسط مرحله رشد رکود بود. این آنزیم با استفاده از ترکیبی از روش های رسوب گذاری با استون، کروماتوگرافی تعویض یونی Q سفاروز و ژل فیلتراسیون خالص سازی شد. آنزیم تک واحدی بوده و وزن مولکولی آن در ژل الکتروفورز بین 38 تا 43 کیلودالتون تخمین زده شد. آنزیم بهینه فعالیت را در دمای 60 درجه سانتی گراد،8.5 pH و بین 0 تا 0.5 مولار نمک سدیم کلراید با تحمل پذیری حداکثر تا 4 مولار نمک نشان داد. این پروتئاز یک زینک متالوپروتئاز شناخته شد که بوسیله EDTA،1 و 10 فنانترولین شدیدا مهار می گشت. این نتایج پیشنهاد می کند که پروتئاز تولید شده بوسیله باکتری Salinibacter sp. Strain AF-2004 به خاطر فعالیت در محدوده وسیعی از pH بین 5 تا 10، ترموفیل بودن نسبی فعالیت آنزیم و بعلاوه تحمل پذیری بالا به محدوده وسیعی از غلظت های نمک از دیدگاه صنعتی ارزشمند است.



کلیدواژگان: پروتئاز قلیایی، هالوآلکالوفیل، باکتریهای نمک دوست نسبی، تولید پروتئاز

 
 
Title:

Isolation of alkaline protease producing halophilic bacteria and effect of various factors on production and purification of enzyme



Abstract:

Proteases represent one of the most important groups of industrial enzymes. The proteases isolated from halophilic organisms are likely to mimic some unnatural properties that are desirable for biotechnological applications.
Among the 82 strains of moderately halophilic bacteria that were isolated  from different salty areas of Iran, tow strains, MA-2 and AF-2004 were selected as the best producer of extracellular protease and were used for further studies. Phenotypic characterization and 16S rRNA sequence analysis placed Strain MA-2 and strain AF-2004 in the genus Halobacillus and Salinivibrio, respectively.
The production of a protease in Halobacillus strain MA-2 was investigated under conditions of high salinity in a basal medium containing peptone, beef extract, maltose and NaCl when the culture reached the stationary growth phase. Effect of various temperatures, initial pH, salt and different nutrient sources on protease production revealed that the maximum secretion occurred at 34oC, pH 8.0–8.5, and in the presence of gelatin. Replacement of NaCl by various concentrations of sodium nitrate in the basal medium also increased the protease production. The secreted protease was purified 24-fold with 68% recovery by a simple approach including a combination of acetone precipitation and Q-Sepharose ion exchange chromatography. The enzyme revealed a monomeric structure with a relative molecular mass of 36 kDa by running on SDS-PAGE. Maximum caseinolytic activity of the enzyme was observed at 50oC, pH 9.0 and 0.5 M NaCl, although at higher salinities (up to 3 M) activity still remained. Moreover, the enzyme activity was strongly inhibited by phenylmethylsulfonyl Xuoride (PMSF), Pefabloc SC and EDTA; indicating that it probably belongs to the subclass of serine metalloproteases. These findings suggest that the protease secreted by Halobacillus sp. strainMA-2 has a potential for biotechnological applications from its haloalkaline properties point of view.
An extracellular protease was produced by Salinivibrio sp. Strain AF-2004 in a basal medium containing peptone, beef extract, glucose and NaCl. The isolate was capable of producing protease in the presence of sodium chloride, sodium sulfate, sodium nitrate, sodium nitrite, potassium chloride, sodium acetate and sodium citrate. The maximum protease was secreted in the presence of 7.5 to 10% (w/v) sodium sulfate or 3% (w/v) sodium acetate (4.6 Uml_1). Various carbon sources including glucose, lactose, casein and peptone were capable of inducing enzyme production. The optimum pH, temperature and aeration for enzyme production were 9.0, 32oC and 220 rpm, respectively. The enzyme production corresponded with growth and reached a maximum level during the mid-stationary phase.
This protease was purified to homogeneity by a combination of acetone precipitation, Q-Sepharose ion exchange and Sephacryl S-200 gel filtration chromatography. The enzyme was a monomeric protease with a relative molecular mass of 38–43 kDa by SDS-PAGE and gel filtration chromatography. The enzyme exhibited its optimal activity at 60oC, pH 8.5, and 0–0.5M NaCl with a high tolerance to salt concentrations of up to 4M.
The protease was identified as a zinc-metalloprotease, which was strongly inhibited by EDTA and 1, 10-phenanthroline. These results suggest that the protease secreted by Salinivibrio sp. strain AF-2004 is industrially important from the perspectives of its activity at a broad pH ranges (5.0–10.0), its moderate thermoactivity in addition to its high tolerance to a wide range of salt concentration.



Keyword(s): Alkaline protease, Haloalkaliphile, Moderately halophilic bacteria, Protease production