مشخصات

عنوان:

شناسایی مارکر‌های ملکولی اسپرماتوژنز در مایع منی مردان مبتلا به آزواسپرمی غیرانسدادی



گروه تخصصی:  پزشکی

سازمان مجری:  پژوهشکده فنآوریهای نوین علوم پزشکی ابن سینا 

گروه پژوهشی: غدد تولیدمثل و جنین شناسی

پژوهشگران: 
صادقی محمدرضا (مسئول طرح)
آخوندی محمدمهدی (همکار طرح)
مدرسی محمدحسین (همکار طرح)
امیرجنتی ناصر (همکار طرح)
زراعتی حجت (همکار طرح)
سلطان قرایی هاله (همکار طرح)
اصلانی فریال (همکار طرح)
حجت مهشید (همکار طرح)
اصغرپور لیما (همکار طرح)

تاریخ خاتمه:  1387

کارفرما: معاونت پژوهش و فناوری جهاددانشگاهی

خروجی طرح: 

چاپ مقاله در Journal of Reproduction & Infertility 2007; 8(3):195-204. 


نوع: کاربردی

 
تلفن: 22432020-021

نشانی سازمان مجری: تهران، بزرگراه شهید چمران، اوین، دانشگاه شهید بهشتی، انتهای بلوار داخل دانشگاه
 

چکیده:

زمینه و هدف: بسیاری از مردان نابارور مبتلا به آزواسپرمی غیر انسدادی هستند. امروزه معمولترین روش برای ارزیابی وضعیت اسپرماتوژنز در این افراد انجام جراحی بیوپسی بیضه است. بررسی الگوی بیان ژنهای اختصاصی بیضه در این بیماران و استفاده آن به عنوان مارکر مولکولی برای پیش بینی حضور اسپرم در بیضه این بیماران منجر به پیشرفتی با اهمیت در روشهای درمانی خواهد شد. محتوای mRNA مایع منی می تواند اطلاعات ارزشمندی درباره وضعیت اسپرماتوژنز در بیضه بیمار فراهم کند که با روشهای سنتی هیستوپاتولوژی قابل شناسایی نیستند.
روش بررسی: در این مطالعه الگوی بیان ژنهای اختصاصی بیضه
DAZ، AKAP4، CSNK2a2، PRM1 و PRM2 بررسی و مقایسه بین نتایج مولکولی و پاتولوژی بیماران انجام شد. برای این کار تعداد 203 بیمار مبتلا به آزواسپرمی غیر انسدادی مراجعه کننده به مرکز درمان ناباروری و سقط مکرر ابن سینا مورد بررسی قرار گرفتند. نمونه بیوپسی بافت بیضه توسط متخصص پاتولوژی در امور ناباروری ارزیابی شد. همچنین مقادیر هورمونهای FSH، LH و تستوسترون در سرم خون بیماران اندازه گیری شد.
استخراج
RNA از رسوب مایع منی با استفاده از محلول RNAbee صورت گرفت. با استفاده از آنزیم رونویسی معکوس، رشته cDNA از روی RNA سنتز شده و تکثیر شد. صحت و تمامیت cDNA حاصل با استفاده از PCR با پرایمرهای اختصاصی ژن تنظیمی بتااکتین آزمایش شد. با استفاده از پرایمرهای اختصاصی طراحی شده برای ژنهای مورد نظر PCR انجام شد. نمونه بیوپسی بیضه حاوی مراحل اسپرماتوژنز نرمال بعنوان کنترل مثبت داخلی در PCR ژنهای اختصاصی بیضه بکار گرفته شد.  
یافته ها: نمونه های بتااکتین مثبت برای مطالعه انتخاب شدند (110 بیمار). نتایج مولکولی ژنهای
DAZ، PRM1 و PRM2 با نتایج پاتولوژی همراهی معنی داری نشان داد. درحالیکه ژنهای AKAP4 و CSNK2a2 همراهی معنی داری با نتایج پاتولوژی نداشتند. مقایسه نتایج مولکولی و مقادیر هورمونها نشان داد که زمانیکه مقادیر هورمونهای LH و FSH در حد طبیعی یا بیشتر و هورمون تستوسترون در حد طبیعی با کمتر بود، نتایج مولکولی با نتایج پاتولوژی مشابهت نشان داد. نتایج مولکولی مربوط به 7 بیمار با نتیجه پاتولوژی آپلازی سلول ژرمینال مثبت بود که حضور اسپرماتوژنز در بیضه این افراد را بر خلاف نتیجه پاتولوژی تایید کرد.
نتیجه گیری: معرفی این روش مولکولی غیرتهاجمی به عنوان یک تست تشخیصی با استفاده از رونوشتهای
PRM1 و PRM2 و AKAP4 و نیز b-actin به عنوان ژن کنترل داخلی در مایع منی به پزشکان کمک خواهد کرد که وضعیت اسپرماتوژنز در بیضه مردادن مبتلا به آزواسپرمی غیر انسدادی را پیش بینی نمایند و از انجام بیوپسی های غیر ضروری به عنوان یک روش تهاجمی بر روی تعداد بسیاری از این مردادن جلوگیری شود.



کلیدواژگان: آزواسپرمی غیر انسدادی، مارکر مولکولی، آپلازی سلول ژرمینال، ناباروری مردان، مایع منی، سلولهای ژرمینال، توقف اسپرماتوژنز، بیوپسی بیضه، استحصال اسپرم از بافت بیضه، پروتامین

 
 
Title:

Identification of molecular markers for spermatogenesis in semen of non-obstructive Azoospermic men



Abstract:

Background & Aim: A large number of infertile men suffer from non-obstructive azoospermia. To evaluate their spermatogenesis status, they must undergo the invasive procedure of testicular biopsy. Analyzing the expression pattern of testis-specific genes and using them as molecular markers of testicular spermatogenesis will lead to a drastic change in therapeutic approaches. Furthermore, mRNA content of the semen gives us most valuable information about the patient's spermatogenesis level which is almost undetectable by histopathological methods. In this study, in comparison with histopathological results, the expression of testis specific genes, DAZ, AKAP4, CSNK2a2, PRM1 and PRM2 as molecular markers was monitored.
Material & Methods: Azoospermic men (203 persons) who underwent testicular biopsy at the Avesina Infertility Clinic (AIC), Tehran, Iran were included in this study. Biopsied testicular tissue was used for histologic evaluation by an expert clinical pathologist. In addition to semen analysis, the level of LH, FSH and testosterone was measured in patients' serum and was compared with the molecular results.
Total RNA was extracted from the semen pellets using RNAbee reagent. First-strand cDNA was synthesized and subsequently amplified using M-MuL V RT. PCR was carried out using sequence specific primers for above testis-specific genes and as ?-actin a house keeping gene. Testis biopsies showing normal spermatogenesis were used as positive controls.
Results: PCR for testis-specific genes was carried out on
b-actin positive samples (110 patients). Molecular results for DAZ, PRM1 and PRM2 genes were in agreement with the histopathological results. However AKAP4 and CSNK2a2 genes showed insignificant agreement with the pathology. Comparing hormonal and molecular results was showed large number of men with spermatogensis failures had normal levels of LH and FSH and testosterone. Interestingly, there were 7 patients with germ cell aplasia who had positive molecular results which show the presence of focal spermatogenesis in their testis.
Conclusion: Introduction of this non-invasive molecular diagnostic tool, Using PRM1, PRM2 and AKAP4 transcripts in semen along with DAZ as a testis-specific internal control can help clinicians to predict the presence of spematogenesis in testis of NOA men and will prevent to undergoing unnecessary testicular biopsies in most patients.



Keyword(s): male infertility, Semen, Immature germ cells, non-obstructive azoospermia, spermatogenesis Arrest, TESE, Testicular biopsy, Germ cell aplasia, Molecular marker, Protamine