برای اطلاع از آخرین مقالات علمی و اخبار کرونا(COVID-19) کلیک کنید

مشخصات

عنوان:

انتخاب اسپرم های سالم بر مبنای مارکرهای مولکولی سطح اسپرم



گروه تخصصی:  پزشکی

سازمان مجری:  پژوهشکده فنآوریهای نوین علوم پزشکی ابن سینا 

گروه پژوهشی: جنین شناسی و آندرولوژی

پژوهشگران: 
صادقی محمدرضا (مسئول طرح)
آخوندی محمدمهدی (همکار طرح)
جدی تهرانی محمود (همکار طرح)
زرنانی امیرحسن (همکار طرح)
ربانی حجت اله (همکار طرح)
کمالی کوروش (همکار طرح)
لک پور نیکنام (همکار طرح)
هادوی رضا (همکار طرح)
محمودی سیداحمدرضا (همکار طرح)
محمودیان جعفر (همکار طرح)

تاریخ خاتمه:  تیر 1393

کارفرما: 

خروجی طرح: 
 
تلفن: 22432020-021

نشانی سازمان مجری: تهران، بزرگراه شهید چمران، اوین، دانشگاه شهید بهشتی، انتهای بلوار داخل دانشگاه
 

چکیده:

مقدمه: تزریق اسپرم به داخل سیتوپلاسم تخمک (ICSI) به عنوان یک روش مناسب در درمان ناباروری می باشد. در این روش موانع طبیعی برای لقاح شامل ظرفیت پذیری و واکنش آکروزومی وجود ندارد. انتخاب اسپرم بر اساس خصوصیات ظاهری مانند تحرک و مورفولوژی انجام می شود و سلامت DNA و بلوغ کروماتین مورد ارزیابی قرار نمی گیرند. بنابراین وجود روش هایی که بتواند علاوه بر خصوصیات ظاهری، اسپرم هایی با فراگمنتاسیون کمتر DNA و بلوغ بیشتر کروماتین را جدا کند ضروری می باشد. بدین منظور در این مطالعه از فیبرونکتین به عنوان بیومارکری جهت ارزیابی وضعیت DNA و بلوغ کروماتین اسپرم استفاده گردید. فیبرونکتین یکی از گلیکوپروتئین های سطحی اسپرم و غشای پایه توبول سمی نیفروس می باشد و نقش مهمی را در برهمکنش اسپرم- تخمک و فرایند لقاح ایفا می کند.
مواد و روش ها: از آنجا که اساس کلی جداسازی اسپرم ها در این پژوهش آنتی بادی ضد فیبرونکتین می باشد، ابتدا اقدام به تولید آنتی بادی پلی کلونال علیه فیبرونکتین گردید. سپس کارایی آنتی بادی تولید شده با استفاده از آزمون های
SDS-PAGE، الایزا، ایمونوبلاتینگ، ایمونوسیتوشیمی و فلوسایتومتری مورد ارزیابی قرار گرفت. در مرحله بعد جهت بررسی کیفیت اسپرم های حاوی فیبرونکتین، مایع منی ١٥فرد نورموزواسپرمی پس از جداسازی به روش DGC با استفاده از آنتی بادی پلی کلونال ضد فیبرونکتین و goat anti rabbit کونژوگه با بید مغناطیسی بر روی ستون های MACS بارگذاری شد. سپس سه جمعیت (اسپرم های جداسازی شده توسط DGC، باند نشده به ستون و باند شده به ستون) از نظر محتوای فیبرونکتین و درصد زنده بودن مورد بررسی قرار گرفتند. در نهایت یکپارچگی DNA و بلوغ کروماتین در همه گروه های ذکر شده توسط تست های SCSA و رنگ آمیزی CMA3 به روش فلوسایتومتری ارزیابی گردید.
نتایج: آنتی بادی تولید شده در تست های الایزا، ایمونوبلاتینگ، ایمونوسیتوشیمی و فلوسایتومتری به خوبی قادر به شناسایی فیبرونکتین بود. همچنین نتایج حاصل از جداسازی اسپرم ها بر اساس بیومارکر فیبرونکتین نشان داد که استفاده از ستون های
MACS به طور معناداری باعث افزایش میانگین درصد اسپرم های حاوی فیبرونکتین در فراکسیون باند شده به ستون در مقایسه با اسپرم های باند نشده به ستون و اسپرم های جداسازی شده به روش DGC گردید (به ترتیب 10.35± 77.34در مقابل 2.16±2.36 و 10.36±12.45) (p<0.001). علاوه بر این در جمعیت اسپرم های حاوی فیبرونکتین، شاخص شکستDNA) ) DFI بسیار کمتر از اسپرم های باند نشده به ستون و اسپرم های جداسازی شده به روش DGC بود (به ترتیب 2.04±1.06 در مقابل ٦±5.93 و 11.29±9.03) (p<0.001). همچنین میزان اسپرم های دارای کروماتین نابالغ در جمعیت حاوی فیبرونکتین به طور معناداری کمتر از اسپرم های باند نشده به ستون و اسپرم های جداسازی شده به روش DGC بود (به ترتیب 8.23±25.4 در مقابل10.28 ±48.61 و 10.9±41.1 (p<0.001).
بحث و نتیجه گیری: همه روش های موجود در ارزیابی بلوغ کروماتین و یکپارچگی
DNA با تخریب اسپرم همراه بوده و استفاده از آنها در درمان ناباروری غیرممکن می باشد. لذا فیبرونکتین می تواند به عنوان بیومارکری مناسب جهت جداسازی اسپرم هایی با کروماتین بالغ تر و فراگمنتاسیون کمتر DNA از سایر اسپرم ها بدون هرگونه آسیب به ساختار اسپرم در نظر گرفته شود. مطالعات جامع تر در آینده بر روی فیبرونکتین و ارتباط آن با کیفیت اسپرم، بکارگیری آن را در ناباروری مردان و روش های کمک باروری تقویت خواهد کرد.



کلیدواژگان: فیبرونکتین، جداسازی اسپرم، کروماتین اسپرم، شکست DNA

 
 
Title:

Sperm selection based on molecular markers on spermatozoa surface



Abstract:

Introduction: ICSI (Intracytoplasmic Sperm Injection) is a suitable assisted method in treatment of infertility. There isn’t a natural barrier for fertilization including capacitation and acrosome reaction in ICSI. Since the selection of sperm is usually based on appearance properties such as motility and morphology, sperm DNA integrity and chromatin maturity cannot be assessed. So, it is necessary to use methods that enable for separating sperm with low DNA fragmentation and high chromatin maturity. In this regard, Fibronectin was nominated as a biomarker for assessment of DNA status and chromatin maturity. Fibronectin is a glycoprotein on spermatozoa surface and basement membrane of the seminiferous tubule. It play important role in sperm-egg interaction and fertilization.
Material and methods: In this study fibronectin antibodies were basis of sperm selection. Thus, the first step was production of polyclonal antibody against Fibronectin. Then efficiency and sensitivity of produced antibody were assessed by SDS-PAGE, ELISA, Immunoblotting, Immunocytochemistry (ICC) and flow cytometry. In the next step, the semen sample of 15 normozospermic men after density gradient centrifugation (DGC) were loaded on MACS column (Miltenyi Biotech, Germany) using polyclonal anti fibronectin antibody and goat anti rabbit conjugated microbeads (AFN-MB). The three populations of sperm (DGC selected, unbounded and bounded) were evaluated for vitality and fibronectin content. Finally, DNA integrity and chromatin maturity were assessed using SCSA method and CMA3 staining by flow cytometry in all mentioned categories.
Results: The produced polyclonal anti-Fibronectin antibody was able to detect Fibronectin using ELISA, Immunoblotting, ICC and flow cytometry. Moreover, the MACS column increased FN-positive sperm significantly in bounded fraction compared to unbound and DGC selected fractions (77.34%±10.35 % vs. 2.36%±2.16% and 12.45%±10.38%, respectively; p<0.001). In addition FN-positive population has DNA fragmentation index (DFI) lower than DGC selected and unbound sperm (1.06%±2.04% against 9.03%±11.29% and 5.93%±6, respectively; p<0.001) as well as chromatin maturity assessed with CMA3 staining (25.4%±8.23% against 41.13%±10.9% and 48.61%±10.28% p<0.001).
Conclusion: All present methods applied in evaluation of sperm chromatin maturity and DNA integrity may induce sperm degradation and use of these methods is impossible in treatment of infertility. So, Fibronectin can be considered as a positive marker in sperm selection with mature chromatin and low DNA fragmentation from another sperm without adverse effect in sperm structure. Further comprehensive studies on FN in relation to sperm quality will reinforce its application in male infertility and ART in future.



Keyword(s): Fibronectin, Sperm selection, Sperm chromatin, DNA fragmentation