برای اطلاع از آخرین مقالات علمی و اخبار کرونا(COVID-19) کلیک کنید

مشخصات

عنوان:

ساخت کیت ترانسفورماسیون باکتری اشریشیاکلی با کارایی بالا جهت تسریع در تولید پروتئین نوترکیب



گروه تخصصی:  پزشکی

سازمان مجری:  پژوهشکده فنآوریهای نوین علوم پزشکی ابن سینا 

گروه پژوهشی: میکروبیولوژی

پژوهشگران: 
نژادمقدم محمدرضا (مسئول طرح)
باباشمسی محمد (همکار طرح)
نیاکان محمد (همکار طرح)
هادوی رضا (همکار طرح)

تاریخ خاتمه:  دی ماه 1385

کارفرما: معاونت پژوهش و فناوری جهاد دانشگاهی

خروجی طرح: 

- ارائه 2 خلاصه مقاله در مجامع داخلی و خارجی


نوع: کاربردی

 
تلفن: 22432020-021

نشانی سازمان مجری: تهران، بزرگراه شهید چمران، اوین، دانشگاه شهید بهشتی، انتهای بلوار داخل دانشگاه
 

چکیده:

ترانسفورم سازی سلول های باکتری مستعد به جذب DNA پلاسمیدی، نقش محوری را در تکنیک های کلون سازی مولکولی ایفا می کند.
در حال حاضر عمل ترانسفورم سازی یا به روش شیمیایی و یا به روش فیزیکی مثل الکتروپوریشن انجام می شود. روش الکتروپوریشن به دلیل کارایی بالا در تولید تعداد زیاد سلول ترانسفورم شده، بر روش شیمیایی برتری دارد؛ ولی به دلیل نیازمندی روش الکتروپوریشن به تعداد زیادی از سلول مستعد و DNA پلاسمیدی، مرگ تعداد زیادی از سلول ها طی فرآیند و همچنین نیاز به ابزارهای اختصاصی و عدم فراهم بودن این ابزارها در بسیاری از آزمایشگاه ها، زیاد مورد کاربرد قرار نمی گیرد.
در روش ما که بر اساس اصلاحات انجام گرفته در روش های Chung در سال 1989،Inoue  و همکارانش در سال 1990 و همچنین Chen و همکارانش در سال 2001 طراحی شده است. رسوب سلولی حاصل از 3 میلی لیتر کشت باکتری (OD رشد در طول موج 600 نانومتر حدود 0.4-0.5 باشد) را با 1 میلی لیتر از محلول سرد CTS (%2 tryptone ، 0.5% yeast extract،10 mM PIPES ، 10 mM MgSO4، 10 mM MgCl2،10 mM Nacl ،5% DMSO ، 10% PEG ، 15 mM CaCl2, 55 mM MnCl2 at a final pH of 6.5) به حالت سوسپانسیون در آوردیم و به 500 میکرولیتر از این سوسپانسیون 1 میکرولیتر DNA پلاسمیدی (با غلظت 1 نانوگرم در هر میکرولیتر) اضافه کرده، پس از انکوباسیون آن در دمای 4 درجه سانتی گراد به مدت 30-5 دقیقه به آن 10 میکرولیتر از گلوکز 1 مولار اضافه شد. سپس برای 1 ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد همراه با عمل شیکینگ (225rpm) انکوبه نموده و 100 میکرولیتر از آن را در پلیت انتخابی LB آگار حاوی 100 میلی مولار کلسیم کلراید پخش کردیم. در این روش نیازی به مرحله استفاده از شوک گرمایی نمی باشد و کارایی آن بیشتر از انواع روش های کلاسیک است (حدود 108-107 ترانسفورم شده در هر میکروگرم DNA پلاسمیدی). روش ما به عنوان یک روش ساده و راحت برای تهیه همزمان سلول های مستعد و ترانسفورم سازی آنها مطرح می باشد. چرا که در این روش مراحل سانتریفیوژ، شستشو و انکوباسیون طولانی مطرح در روش های معمول ترانسفورم سازی جهت ذخیره طولانی مدت سلول های باکتریCompetence  حذف گردید.



کلیدواژگان: ترانسفورم سازی، اشریشیاکلی، محلول CTS

 
 
Title:

Developing a rapid E.coli transformation kit with high efficiency for speed up in recombinant protein production



Abstract:

Transformation of DNA plasmids into bacterial competent cells is a key technique in molecular cloning. Transformation can be achieved using either chemical or physical methods, e.g., electroporation. Electroporation offers several advantages over chemical methods, such as high transformation efficiency, but due to the high numbers of cells and plasmids needed, as a result of the high death rate of cells during this process, and also requirement-special equipment for electroporation that many laboratories cannot provide, its application is limited.
In our method which is the same of modified Chung (1989), Inoue et al (1990) and Chen et al (2001) methods were performed as follows: first the pellet of 3ml E.coli culture cells (OD 600nm 0.4-0.5) was prepared and resuspeded at one ml of ice-cold CTS solution (which consist of 0.5% yeast extract, 2% tryptone, 10% PEG, 5% DMSO, 10mM NaCl, 10mM MgCl2, 10mM MgSO4, 10mM PIPES, 15mM CaCl2 and 55 mM MnCl2 at a final pH of 6.5). A 500
ml of this resuspend solution was transferred into a cold microtube, mixed with 1 ml (1ng) of plasmid DNA, and incubated for 5-30 minutes at 4oC. Next 10 ml of 1 M glucose was added, and the cells are grown at 37oC with shaking (225 rpm) for 1 hour. After incubation the cells was spread on selective medium plates containing 100 mM CaCl2 by standard methods. This method doesn’t necessary to heat shoke and it is more efficient than classical transformation methods, 107 to 108 transformants/mg with strains DH5a, and plasmids pGEX-4T-2., our procedure represents a simple and convenient method for competent preparation and transformation simultaneously. Thus, this procedure eliminates the centrifugation, washing, and long-term incubation steps of current methods for long-term storage of competent cells and bacteria can be frozen in N solution without addition of other components.



Keyword(s): Transformation, Escherichia coli, CTS solution