تهیه IgM موشی با استفاده از سلول هیبریدوم و استفاده از آن جهت تولید آنتیبادی پلیکلونال علیه IgM موشی به منظور ساخت ستون کروماتوگرافی جذبی

ارائه گزارش نهایی به کارفرما

هدف: در طی مراحل تولید آنتی بادی منوکلونال، پس از به دست آوردن یک سلول هیبریدومای مولد آنتی بادی منوکلونال، نحوه تخلیص آنتی بادی منوکلونال از سوپ کشت سلول یا آسیت، مرحله ای مهم و حساس است که با توجه به کلاس آنتی بادی موردنظر، روش مناسب برای تخلیص، انتخاب می گردد.
برخی از کلونهای هیبریدوما، تولیدکننده آنتی بادی از کلاس IgM هستند. در حال حاضر روشهای متعددی برای تخلیص IgM به کار می روند. در این میان می توان به ژل فیلتراسیون، کروماتوگرافی تعویض یونی، کروماتوگرافی هیدروفوب و کروماتوگرافی جذبی اشاره کرد. تخلیص IgM موجود در سوپرناتانت سلولی با مشکلات عدیده ای همراه است که معمولا با کاهش بازده تخلیص و از دست دادن آنتی بادی همراه می باشد. برای مثال از معایب استفاده از کروماتوگرافی ژل فیلتراسیون، رقیق شدن نمونه و زمان بر بودن انجام آن است؛ مضافا بر اینکه معمولا با یک مرحله تخلیص،IgM  کاملا خالص به دست نمی آید و روشهای دیگری برای رسیدن به خلوص بالاتر لازم است. با توجه به ضرورت ابداع روشی برای امکان تخلیص آنتی بادی منوکلونال از سوپرناتانت سلولی، طراحی روشی سریع، آسان و مقرون به صرفه برای تخلیص IgM تولید شده، ضروری است. در این طرح تصمیم به این گرفته شد که علیه Mouse IgM، آنتی بادی پلیکلونال تهیه شده و نهایتا با این آنتی بادی، ستون کروماتوگرافی جذبی جهت تخلیص آنتی بادی های منوکلونال با کلاس IgM، از سوپ یا آسیت طراحی و ساخته شود.
مواد و روشها: سلول هیبریدومای مولد آنتی بادی منوکلونال با کلاسIgM ، کشت داده شد. پس از آن که تعداد سلولها به حد لازم رسید، با تزریق آنها به موش، آسیت تولید شده و IgM موجود در آسیت با روش کروماتوگرافی ژل فیلتراسیون استخراج گردید. خلوص IgM به دست آمده با SDS-PAGE، سنجیده شد. سپس این IgM به خرگوش تزریق شد تا آنتی بادی پلیکلونال ضد IgM به دست آید. سپس ستون کروماتوگرافی جذبی با لیگاند Mouse IgM ساخته شد و سرم خرگوش ایمن شده باMouse IgM  از این ستون عبور داده شد. آنتی بادی تخلیص شده با این ستون، جهت ساخت ستون کروماتوگرافی جذبی دیگری به کار گرفته شد که با استفاده از این ستون می توان IgM را در زمان کوتاه و با هزینه بسیار کمتر نسبت به روشهای دیگر و نیز با درجه خلوص بسیار بالا از آسیت یا سوپ سلولی تخلیص کرد.
نتایج: پس از کشت سلولها و تزریق آنها به موش، از 1.5cc آسیت به دست آمده،Mouse IgM3.32mg  توسط ژل فیلتراسیون تخلیص شد و پس از تزریق آن به دو خرگوش، آنتی بادی Rabbit Anti Mouse IgM به دست آمده توسط ستون Sepharose-4B-Mouse IgM به مقدار 41mg به دست آمد که با آن دو ستون Sepharose-4B-Rabbit Anti Mouse IgM  ساخته شد و از آن برای تخلیص آنتی بادی منوکلونال با کلاس IgM از سوپ سلولی و آسیت استفاده شد و IgM تخلیص شده کاملا خالص بود.
بحث: با توجه به مطالعات انجام شده و نتایج به دست آمده توسط سایر محققین، تصمیم بر آن گرفته شد که روشی ابداع شود که هم از لحاظ زمانی و هم مالی، مقرون به صرفه باشد. با توجه به اینکه بسیاری از مقالات به تکنیک کروماتوگرافی، اشاره و تاکید کرده اند و برخی نیز کروماتوگرافی جذبی را پیشنهاد نموده اند. عموم روشهای تخلیص IgM، حداقل 2 مرحله ای و برخی 3 یا 4 مرحله ای هستند. علاوه بر این، در برخی روشها بایستی یک یا چند مرحله پروسه ابتدایی روی سوپ یا آسیت حاوی آنتی بادی انجام داد و پس از آن، مرحله اصلی تخلیص IgM را آغاز کرد. اما به کمک ستون کروماتوگرافی جذبی، فقط در یک مرحله میتوان IgM منوکلونال را از آسیت یا سوپ سلولی تخلیص کرد و IgM کاملا خالص به دست آورد.

Antibody purification from soup or ascites is one of the most important steps in the process of monoclonal Antibody production. The best method is selected according to the class of antibodies. Several methods have been introduced in order to IgM purification, for example Gel filtration, Ion exchange, Hydrophobic Chromatography and affinity chromatography.
There are several problems in the purification of IgM antibody from soup or Ascites by Gel filteration, like loss of Antibody, sample dilution. etc. Morever this step is overall time-consuming and has a low efficiency too.
Then, new designing is necessary for IgM purification from soup or ascites. We decided to prepare an affinity chromatography column including Rabbit Anti Mouse IgM for purifying the IgM form ascites and soup.
Material and Methods: Methods as follow:
1) Antibody producing cells were cultured and injected to mice for ascites production. IgM antibodies were purified from ascites by Gel filtration.
2) IgM antibodies were injected to rabbit and antibodies were produced against Mouse IgM in rabbit.
3) Rabbit anti-Mouse IgM was purified by affinity chromatography.
4) In order to purifing Mouse IgM from soup or ascites, affinity column were made by Sepharose-4B- Rabbit Anti Mouse IgM.
Results: Hybridoma lines that produced IgM were cultured and injected into the mouse peritoneum. We collected ascites from peritoneum after 15 days. Finally 3.32 mg mouse IgM was gotten from ascites by gel filtration chromatography. The purified mouse IgM was injected into two rabbits and 41 mg Rabbit Anti Mouse IgM were gotten by passing rabbits’ sera from Sepharose-4B-Mouse IgM column. Purified Rabbit Anti Mouse IgM was linked to Sepharose-4B for preparing the Sepharose-4B-Rabbit Anti Mouse IgM column. This column was used for purifying mouse IgM (Monoclonal Antibody) from cell culture and ascites. The results of our study show that purified IgM from ascites and soup by Sepharose-4B-Rabbit Anti Mouse IgM column was absolutely pure.
Discussion: Since IgM purification protocols except affinity chromatography have several steps and also rapid IgM purification were usually recommended, we have designed extremely rapid and easy new method for the purification of IgM antibody.