برای اطلاع از آخرین مقالات علمی و اخبار کرونا(COVID-19) کلیک کنید

مشخصات

عنوان:

تولید آنتی بادی های پلی کلونال و کونژوگه های آنزیمی و فلورسانس تشخیصی و تحقیقاتی



گروه تخصصی:  پزشکی

سازمان مجری:  پژوهشکده ابن سینا 

گروه پژوهشی: علوم پایه پزشکی

پژوهشگران: 
جدی تهرانی محمود (همکار طرح)
شکری فاضل (همکار طرح)

تاریخ خاتمه:  خرداد 1384

کارفرما: سازمان مدیریت و برنامه ریزی کشور و شرکت داروپخش

خروجی طرح: 

ارائه مقاله در سومین همایش ملی بیوتکنولوژی جمهوری اسلامی ایران، دانشگاه فردوسی مشهد، 17 و 18 شهریور 1382


نوع: کاربردی

 
تلفن: 

نشانی سازمان مجری: 
 

چکیده:

آنتی بادی های پلی کلونال توسط کلون های متعددی از لنفوسیت های B تولید و به اپی توپ های گوناگون متصل می گردند. آنتی بادی های پلی کلونال از جهات مختلف از جمله از نظر ایزوتیپ، ایدیوتیپ، ویژگی و میل پیوندی (افینیتی) ناهمگن هستند.

آنتی بادی های پلی کلونال توسط کلون های متعددی از لنفوسیت های B تولید و به اپی توپ های گوناگون متصل می گردند. آنتی بادی های پلی کلونال از جهات مختلف از جمله از نظر ایزوتیپ، ایدیوتیپ، ویژگی و میل پیوندی (افینیتی) ناهمگن هستند.
در این مطالعه بر علیه ایزوتیپ های IgA, IgM, IgD و IgG انسان و زنجیره های سبک Kappa و Lambda، و بر علیه ایمونوگلوبولین موش، خرگوش و گوسفند مشتمل بر 42 فرآورده آنتی بادی پلی کلونال در گوسفند و یا در خرگوش تولید و سپس آنتی بادی های تولیدشده با آنزیم HRP و ماده فلورسانس FITC کونژوگه گردیدند. به منظور دستیابی به IgM, IgA, IgD و IgG و ایمونوگلوبولین انسان از سرم بیماران مبتلا به ملیوممولتیپل و والدنشتروم و یا سرم نرمال و برای ایمونوگلوبولین حیوانات از سرم آنها استفاده شد. وجود پاراپروتئین با الکتروفورز استات سلولز و نوع ایزوتیپ پاراپروتئین با آزمون الایزا بررسی شد. از آنجا که مطلبق با نتایج الایزا، پاراپروتئین IgM و IgA مورد مطالعه به پروتئین A استافیلوکوکی متصل می شد، برای تصفیه آن، از روش جدید کروماتوگرافی متشکل از ستون های جذبی پروتئین G استرپتوکوکی و پروتئین A استافیلوکوکی استفاده گردید. IgG موجود در سرم با ستون پروتئین G گرفته شد و IgM یا IgA به ستون پروتئین A متصل گردید. برای تصفیه IgD از ستون کروماتوگرافی تعویض یونی با رزین DEAE استفاده شد. فراکسیون های حاوی IgD، جهت حذف IgG، از ستون پروتئین A گذشتند و فراکسیون های غیرمتصل به ستون پروتئین A از ستون سفادکس G-100 عبور داده شدند. بر این اساس مولکول IgD با پیک اول از ستون ژل فیلتراسیون خارج گردید. IgG انسان با پروتئین G و ایمونوگلوبولین حیوانات با ستون پروتئین A تخلیص گردید. خلوص تمام فراکسیون ها با آزمون الایزا و SDS-PAGE مورد ارزیابی قرار گرفت. خلوص IgM تصفیه شده با آزمون ایمونوبلات نیز تایید شد. برای احیا باندهای دی سولفید بین دو زنجیره سبک و سنگین ایمونوگلوبولین های انسان از ماده احیا کننده در تیوتریتول (DTT) استفاده گردید.زنجیره های سبک (Lambda, Kappa) و سنگین ایمونوگلوبین ها با استفاده از روش الکتروالوشن تصفیه شدند. خلوص زنجیره ها با استفاده از آزمون الایزا- و SDS-PAEG تایید گردید. زنجیره های سنگین و سبک تصفیه شده با روش الکتروالوشن به عنوان آنتی ژن برای تزریق به حیوانات در نظر گرفته شدند. 250 میکروگرم آنتی ژن برای هر خرگوش و 1میلی گرم آنتی ژن به گوسفند در ادجوانت کامل فروند و در تزریق اول و نصف مقادیر ذکر شده در ادجوانت ناقص فروند در تزریقات بعدی، استفاده شد. جمعا 5 تزریق انجام شد و فاصله تزریق اول تا دوم سه هفته و فاصله بقیه تزریقات دو هفته بود. تیتر آنتی بادی های اختصاصی از خونگیری اول (Pre-immune) تا خونگیری ششم با آزمون الایزای غیرمستقیم بررسی شد و نشان داده شد که با اولین تزریق تیتر آنتی بادی در هر دو گونه بالا رفته است که این میزان در گوسفند بیشتر از خرگوش است. تیتر آنتی بادی های تولید شده با کروماتوگرافی جذبی با آنتی ژن ویژه خود، تصفیه شد. در مواردی، واکنش متقاطع آنتی بادی ها با کروماتوگرافی جذبی حذف گردید. همچنین قطعه F(ab) 2 با استفاده از آنزیم پپسین تولید گردید و به تفکیک با آنزیم پراکسیداز و فلورسئین ایزوتیوسیانات (FITC) متصل گردیدند. واکنش متقاطع کونژوگه های آنزیمی با سایر ایمونوگلوبین ها، زنجیره های سنگین آنها و زنجیره های سبک κ و λ و همچنین با پانل سرم یازده حیوان مختلف مورد ارزیابی قرار گرفت. کونژوگه های فلورسانس ضد IgM و IgD و ضد ایمونوگلوبولین انسان با سلول های کونژوگه های ضد IgA با سلول B27، کونژوگه های ضد ایمونوگلوبولین موش با لنفوسیت موش مجاور شدند و تعداد سلول های رنگ گرفته با دستگاه فلوسایتومتری (FACS) و میکروسکوپ فلورسانس شمارش گردیدند. نتایج نشان دهنده شباهتکونژوگه های فلورسانس تولید شده با کونژوگه تجاری است. تمامی 42 فرآورده موفق به اخذ تاییدیه آزمایشگاه رفرانس وزارت بهداشت، درمان و آموزش پزشکی شده اند.



کلیدواژگان:

 
 
Title:



Abstract:

Keyword(s):