مشخصات

عنوان:

‌تولید آنتی بادی منوکلونال برای سنجش کمی Inhibin B



گروه تخصصی:  پزشکی

سازمان مجری:  پژوهشکده فنآوریهای نوین علوم پزشکی ابن سینا 

گروه پژوهشی: غدد تولیدمثل و جنین شناسی

پژوهشگران: 
صادقی محمدرضا (مسئول طرح)
ناصری نیما (همکار طرح)
بیات علی اکبر (همکار طرح)
قدس رویا (همکار طرح)
حجت مهشید (همکار طرح)
جدی تهرانی محمود (همکار طرح)
آخوندی محمدمهدی (همکار طرح)

تاریخ خاتمه:  خرداد 1388

کارفرما: معاونت پژوهش و فناوری جهاددانشگاهی

خروجی طرح: 

چاپ مقاله در فصلنامه علمی ـ پژوهشی فیض 11(3): 30ـ24، 1386.


نوع: کاربردی

 
تلفن: 22432020-021

نشانی سازمان مجری: تهران، بزرگراه شهید چمران، اوین، دانشگاه شهید بهشتی، انتهای بلوار داخل دانشگاه
 

چکیده:

مقدمه: Inhibin پروتئینی است که در پاسخ به اثر FSH توسط سلول های گرانولوزا به داخل مایع فولیکولی و جریان خون وریدی تخمدان ترشح می شود. ترشح Inhibin بیشتر به صورت پاراکراین تنظیم می شود و نتیجتا اینکهInhibin  به صورت پس نورد منفی باعث کنترل ترشح FSH از هیپوفیز قدامی می شود. مطالعات انجام گرفته نشان می دهد که Inhibin نقش ارزنده ای در آگاهی از وضعیت باروری در هر دو جنس دارد. یکی از ابزارهای اساسی جهت تشخیص، اندازه گیری و ردیابی این مولکول، استفاده از آنتی بادی مونوکلونال است که در کیت های  اندازه گیری و تشخیصی مختلف کاربرد دارد. لذا هدف اصلی این تحقیق تولید آنتی بادی اختصاص (مونوکلونال - پلی کلونال) بر علیه مولکول Inhibin انسانی و متعاقب آن تخلیص Inhibin از مایع فولیکولی جهت استفاده بعدی از آن برای طراحی روش های اندازه گیری و انجام مطالعات پایه و بالینی مختلف می باشد.
مواد و روشها: سکانس 32-1 زنجیره مولکول Inhibin انسانی را با پروتئین حامل KLH کونژوگه کرده و به حیوانات آزمایشگاهی (موش و خرگوش) تزریق گردید. جهت تولید آنتی بادی مونوکلونال، سلول های لنفوسیتی را از غدهpopliteal  استخراج و با سلول میلومائی SP2/0 هیبرید گردید. پس از چهار بار عمل کلون کردن، کلون های پایدار مولد آنتی بادی اختصاصی ایجاد گردیده و جهت تولید انبوه آن از مایع آسیت کمک گرفته شد. پس از تخلیص این آنتی بادی اختصاصی، با اتصال آن به ستون Sepharose 4B فعال شده توسط CNBr، ستون کروماتوگرافی افینیتی تهیه گردید. پروتئین های مایع فولیکولی را توسط سولفات آمونیوم رسوب داده و از این ستون کروماتوگرافی افینیتی عبور داده تا Inhibin موجود در آن تخلیص گردد. جهت اثبات تخلیص از تست SDS-PAGE و جهت بررسی آنتی بادی و اتصال آن با مولکول Inhibin از تستهای وسترن بلات و الایزا کمک گرفته شد. علاوه بر این بوسیله آزمون الایزا کلاس آنتی بادی مونوکلنال اختصاصی تعیین گردید.
نتایج: در مجموع برای تولید آنتی بادی مونوکلنال چهار مرتبه عمل فیوژن انجام گرفت. از چهار فیوژن انجام شده تعداد 9 کلون پایدار مولد آنتی بادی اختصاصی علیه مولکول Inhibin به دست آمد. هر 9 کلون انتخاب شده قادر به واکنش با پپتید طراحی شده به عنوان ایمونوژن بودند، ولی از این تعداد تنها یک کلون قادر به شناسایی Native Inhibin موجود در مایع فولیکولی می باشد که کلاس آن از نوع IgM می باشد. بعد از تخلیص آنتی بادی و ساخت ستون کروماتوگرافی افینیتی و عبور مایع فولیکولی از ستون، مقدار 4.62 میکروگرم پروتئین Inhibin خالص بدست آمد و وجود باند 32 کیلو دالتونی بعد از رنگ آمیزی نقره موید تخلیص Inhibin می باشد و نتیجه مثبت آزمون وسترن بلات (هم با روش احیا و هم غیر احیا) نشان دهنده شناسایی اپی توپ خطی (linear) توسط آنتی بادی مورد نظر (کلون 3E4-B8) می باشد.
بحث: آنتی بادی بدست آمده متعلق به کلاس IgM بوده که در نوع خود بسیار ارزشمند می باشد، زیرا به علت تشکیل پنتامر توسط آنتی بادیهای IgM کاربرد آن در روشهای کدورت سنجی، آگلوتیناسیون، نفلومتری ارزشمند خواهد بود. یکی از علل تولید این کلاس از آنتی بادی احتمالا نوع روش ایمونیزاسیون حیوان می باشد. علاوه بر این با توجه به اینکه آنتی بادی کلاس IgG برای طراحی سایر روشهای اندازه گیری همواره نیاز می باشد، استفاده ازNative Inhibin  به عنوان ایمونوژن برای ایمیونیزاسیون مجدد و تولید IgG توصیه می شود.



کلیدواژگان:

 
 
Title:

Production of Monoclonal antibodies raised against Inhibin B



Abstract:

Introduction: Ovarian granulose cells secrete into the follicular fluid a gonadal glycoprotein termed Inhibin, which preferentially inhibits FSH Secretion by anterior pituitary cells by negative-feedback. Studies showed that measurement of Inhibin has a clinical role in understanding of situation of fertility. One of the basis tools for diagnostic, measurement and screening of monoclonal antibody. Therefore the aim of this research is to producing specific antibody (monoclonal and polyclonal) against 1-32 ? subunit of Inhibin and afterwards purification of Inhibin from human follicular fluid for design of measurement methods of Inhibin.
Material and Methods: 1-32 ? subunit of Inhibin conjugated with KLH and then injected to mice and rabbit lymphocyte cells from popliteal lymphonodes obtained and with SP2/0 Myelloma cells hybridized. After 5 times cloning, permanent clones producer specific antibody established. Mass production of monoclonal antibody performed by ascites fluid. After purification of monoclonal antibody, this purified monoclonal antibody connected to CNBr-activated Sepharose 4B for preparation of affinity chromatography column. Then human follicular fluid was precipitated with ammonium sulfate for concentration of Inhibin. This concentration was fractionated from affinity chromatography. After purification of Inhibin, SDS-PAGE and western blotting performed.
Results:  From 4 fusions, 9 permanent clones producer specific antibody against 1-32 a subunit of obtained and only one of them able to recognize native in follicular fluid and its class is IgM. After purification of monoclonal antibody and producing of affinity chromatography column and transferring follicular fluid from this column, 4. 62 ug  purified and concentrated. 32 kDa bands are observed with AgNO3 staining. Positive Westen blotting (with- 2 ME and without 2-ME) indicated that specific antibody (3E4-B8 clone) able to recognize linear epitope.
Discussion: According to class of monoclonal antibody was IgM and this class of antibody is very sensitive to freezing and thawing, therefore propose to obtain the monoclonal antibody against Inhibin, shift the immunization method from foot-pad to intra peritoneal to produce specific antibody from IgG class. The using of follicular fluid for mass isolation of Inhibin is time-cosuming, costly and sensitive process. Therefore advise that for having mass Inhibin, produce recombinant Inhibin in host.



Keyword(s):