برای اطلاع از آخرین مقالات علمی و اخبار کرونا(COVID-19) کلیک کنید

مشخصات

عنوان:

طرح لقاح و تکامل تخمکهای ژرمینال وزیکل منجمد شده موش



گروه تخصصی:  پزشکی

سازمان مجری:  پژوهشکده علوم سلولی (رویان) 

گروه پژوهشی: پژوهشی جنین شناسی

پژوهشگران: 
رضازاده ولوجردی مجتبی (مسئول طرح)
ایمانی حسین (همکار طرح)
حسینی احمد (همکار طرح)

تاریخ خاتمه:  بهار 1382

کارفرما: 

خروجی طرح: 
 
تلفن: 23562000-021

نشانی سازمان مجری: تهران، بزرگراه رسالت، خیابان بنی هاشم شمالی، میدان بنی هاشم، خیابان حافظ شرقی، پژوهشگاه رویان
 

چکیده:

علیرغم تلاش های فراوانی که در دهه اخیر جهت بهبود روشهای انجماد و ذوب تخمک انجام شده، مشکلات عدیده ای برای تخمکهای اوولیت شده از قبیل از هم گسیختگی دوک تقسیم، از دست دادن میرکروتوبولها، القا رها شدن زودرس گرانولهای قشری تخمک، افزایش سختی ZP، پایین آمدن باروری بوجود می آید. انجماد شیشه ای تخمکهای ژرمینال وزیکلی (Germinal Vesicle; GV) و فولیکولها قبل از فضادار شدن در مراحل اولیه (Early Preantral Follicle; EPAF) EPAF بعنوان روشی جایگزین برای حل برخی از این مشکلات مطرح است.
در پژوهش حاضر پس از بدست آوردن غلظت مناسبی از اتیلن گلیکول در انجماد فولیکولها و تخمکهای ژرمینال وزیکلی، کشت آزمایشگاهی، بلوغ، لقاح و شکل گیری جنینهای دوسلولی مورد بررسی قرار گرفت.
فولیکولهای
EPAF با ابعاد 130-100 میکرومتری پس از جداسازی مکانیکی از تخمدان موشهای 14 روزه، با استفاده از محلول EGFA40 بعنوان محلول انجمادی منجمد و با روش یک مرحله ای و با استفاده از PBS حاوی ساکروز نیم مول ذوب شدند. فولیکولها پس از شستشو با PBS به داخل قطرات 20 میکرولیتری DMEM Ham’s F12 حاوی ترانسفرین، انسولین، rFSH منتقل شدند. نمونه ها هر دو روز یکبار کنترل می شدند. در روز دوازدهم کشت برای القا اوولاسیون به قطرات فولیکولهای AFF hCG (Antrum formation Follicles; AFF) اضافه گردید. تخمکهای اوولیت شده با اسپرم نر همان نژاد Inseminate شده و میزان MII, GVB, GV شکل گیری جنینهای دوسلولی در هر دو گروه فولیکولهای منجمد شده، شیشه ای و غیرانجمادی ثبت و با هم مقایسه شدند. نتایج حاصل از پژوهش نشان داد که %91.7 فولیکولهای منجمدشده شیشه ای پس از ذوب شکل طبیعی داشتند و بعد از 12 روز کشت، %49 از فولیکولهای منجمد شیشه ای زنده ماندند و %47 آنها تا مرحله AFF پیش رفتند در حالی که در گروه کنترل %66.1 تا مرحله AFF رسیدند. در میزان GVB و MII و جنینهای دوسلولی در هر دو گروه تفاوت معنی داری بدست نیامد.
تخمک های
GV از تخمدان موشهای 6-4 هفته ای بروش مکانیکی جدا گردید و با استفاده از محلول EGFA40 منجمد شدند، ذوب با روش یک مرحله ای و با استفاده از PB1 حاوی ساکروز نیم مول انجام شد. تخمکها پس از شستشو با PB1 به داخل قطرات 20 میکرولیتری DMEM-Ham’s F12 حاوی ترانسفرین، انسولین،  rFSHو hCG و FCS یا بدون آنها منتقل گردیدند. 24 ساعت بعد، تخمک های اوولیت شده با اسپرم نر همان نژاد Inseminate گردید و میزان GV و GVB و MII در شکل گیری جنینهای دوسلولی در گروههای منجمد شده شیشه ای و غیرانجمادی ثبت و با یکدیگر مقایسه گردید.
میزان تخمکهای ژرمینال وزیکل منجمد شده شیشه ای در تمام گروهها بین 88 تا 99% بود. تخمکهای
GV منجمد شده شیشه ای علاوه بر بلوغ در محیط کشت DMDM-Ham’s با مواد مختلف جنینهای دوسلولی نیز تشکیل دادند. نتایج پژوهش حاضر نشان داد که تخمکهای GV منجمد شده شیشه ای و غیرانجمادی در محیط کشت حاوی ترانسفرین، انسولین، rFSH، hcG، FCS رشد می یابد. میزان بلوغ تخمک های ژرمینال وزیکل در مایع فولیکول خالص حرارت دیده و تازه انسانی خیلی پایین و بالاترین میزان بلوغ آزمایشگاهی در تخمکهای تخمدان تحریک شده با HMG است.
بر اساس نتایج این پژوهش، استنتاج می شود که تخمک نارس موش منجمد شده شیشه ای و غیرانجمادی
(GV; EPAF) در شرایط کشت موجود در پژوهش حاضر قابلیت از سرگیری میوز و رسیدن به بلوغ هسته ای پس از رفع انجماد را دارند. علاوه بر این تخمکهای بالغ شده در تمام گروهها علاوه بر باروری، جنینهای دوسلولی نیز تشکیل می دهند. لیکن حصول شرایط آرمانی برای انجماد و بلوغ به تحقیقات بیشتری نیاز دارد.



کلیدواژگان: تخمک نارس، اتیلن گلیکول، انجماد شیشه ای، بلوغ آزمایشگاهی، جنین دو سلولی

 
 
Title:

Fertilization and development of frozen- thawed germinal vesicle mouse oocytes



Abstract:

Despite many investigations conduced to improve the methods of oocytes cryopreservations, many problems are associated with the cryopreservation ovulated, including spindle disorganization, loss or clumping of microtubles, induce a premature relase of cotical granules, resulting in the hardening of zona pellucida and low fertilization rate. Therefore vitrified of Early preantral Follicles (EPF) or Germianl Vesicles (GV) Oovytes an alternative approach had been attempte. This study was designed to investigated the finding of proper concentration of ethylenglycol, in vitro maturation, fertilization and 2-cell embryo formation or GV of EPAF Mouse Oocytes following vitrification before in vitro maturation.
Early preantral follicles with the diameter of 100-130?m were isolated mechanically from 14 days old NMRY mice ovaries. Follicles were vitrified using PBI containing 30% W/V Ficoll, 0.5M Sucrose, 105 mg BSA, 10.7% W/V acetamide and 40% V/V ethylene Glycol (EGFA40) as a cryopreservation solution, thawing performed in one step manner using 0.5M sucrose in PBI and then, transferred to the drops of DMEM-Ham’s F12 containing 5%. Intact vitrified and Non-vitrified EPAF were cultured in drops in 20?l of culture medium containing 10?g/ml Transferrein, 5?g/ml Insulin, 100mIU/ml rFSH. At day 2 of culturing, survival follicles in both groups evaluated under invert microscope. EPAF development followed till day 12 culture media renew every two days. At day 12 preovulatory (Antral like formation follicels; AFF) were stimulated with 1.15U/ml hCG.
Results show that 91.7% of vitrified EPAF was normal. A survival rate of 49% was obtained with 47.7% of surviving vitrified EPAFs reaching AFF, after 12 day culturing compared with 66.1 of Non vitrified control EPAFs. There were no significant differences in GVB & MII and 2-cell embryos in two groups.
Germainal vesicle (GV) were isolated mechanically from 4-6 weeks old NMARY mice ovaries. GVs were vitrified using EGAF40. Thawing performed in one step manner, transferred to the drops of media. Vitrified and Non-vitrified GVs were cultured in drops of 20?l of DMEM-Ham’s F12 containing 5% with 10?g/ml Tranferrein, 5?g.ml Insulin, 100IU/ml rFSH, 1.5IU/ml hCG and pure fresh or heated human follicular fluid. After 24 culturing, GV in both groups evaluated under invert microscope. Ovulated oocytes of GV or EPAF inseminated with the capacitated epidydimal sperms of the same strain of mice, Germinal Vesicles (GVs), germinal vesicle breakdown (GVB), extrusion of first polar body, fertilization and development of two cells embryos in vitrified and non-vitrified at 2th day of culturing groups were compared.
A survival rat of vitrified GVS in all of groups were 88%-99%. GVs not only in mature DMEM-Ham’s F12 with different material matured but also matured oocytes were reached to 2-cell embryos. Results shows that vitrified & non-vitrified GVs capable mached to MII from 4ˆ till 25% with DMEM Ham’s F12 containing FCS transferrin, Insulin, hCG and rFSH while the rate of maturation of GVs in pure heated or Non-heated human follicular fluid was very low and the higher rat of in-vitro maturation was obtained from stimulated ovary with HMG.
In Conclusion, this results demonstrate that Vitrified and non-vitrified immature mouse oocytes (GV or EPAF) obtained from unstimulated Ovaries under present cultured condition are able to resumption of meiosis to achieve full nuclear maturation post-thaw. In adition matured oocytes in all groups can fertilized and developed to 2-cell embryo but need more investigation.



Keyword(s): Early preantral follicular Germinal vesicle, Ethylen glucol, vitrification, In-vitro maturation, Germinal vesicle down, 2-cell