برای اطلاع از آخرین مقالات علمی و اخبار کرونا(COVID-19) کلیک کنید

مشخصات

عنوان:

تخلیص پروتئین نوترکیب PEP از باکتری E.coli



گروه تخصصی:  پزشکی

سازمان مجری:  پژوهشکده علوم سلولی (رویان) 

گروه پژوهشی: ژنتیک

پژوهشگران: 
تاریخ خاتمه:  بهمن 1388

کارفرما: پژوهشگاه رویان

خروجی طرح: 

ـ ارائه یک نسخه پایان نامه . M.Sc
ـ پوستر و سخنرانی بین المللی.


نوع: بنیادی

 
تلفن: 23562000-021

نشانی سازمان مجری: تهران، بزرگراه رسالت، خیابان بنی هاشم شمالی، میدان بنی هاشم، خیابان حافظ شرقی، پژوهشگاه رویان
 

چکیده:

این دهه دوران تحقیقات در زمینه پساژنومی است و اگرچه اغلب بانک های ژنومی مملو از اطلاعات ژنتیکی موجودات مختلف است، هنوز عملکرد و محصولات اغلب ژن ها ناشناخته است. امروزه دانش پروتئومیکس پیشرفت شگرفی در زمینه مطالعه فعالیت محصولات ژنی داشته و به عنوان ابزاری توانمند در عرصه درک و شناخت عملکرد ژن ها مد نظر قرار گرفته است. هدف از این بررسی بهینه سازی شرایط لازم جهت تولید پروتئین نوترکیب پراکسیزومی موشی (PEP) در گونه مناسب و مستعد شده از کلی باسیل به نام BL21 بود. پروتئین نوترکیب PEP در مراحل بعد خالص شده و به عنوان بخشی از مطالعات پروتئومیکسی جهت شناسایی اجزای سلولی واکنش دهنده با آن به کار خواهد رفت. در این بررسی وکتور بیان شونده در اشرشیاکلی (pGEX6P2) که در آن ژن PEP در مجاورت ژن GST (گلوتاتیون ـSـ ترانسفراز) دست ورزی و قرار داده شده است به کار گرفته شد. وکتورهای نوترکیب به درون سلول های BL21 که سلول های باکتریائی مناسب جهت بیان پروتئین نوترکیب می باشند، ترانسفورم شدند. سلول های باکتریایی به طور مجزا GST و پروتئین نوترکیب متصل به GST را تحت رقت 2000 برابر در محیط2YT بیان کردند. بعد از 3 ساعت کشت در دمای 37 درجه سانتی گراد، ایزوپروپیل تیوگالاکتوزیداز (IPTG) در غلظت های مختلف به محیط کشت اضافه شد. در گام بعدی کشت باکتری ها در دماهای مختلف تا رسیدن به میزان رشد مناسب بررسی شد. در نهایت مجددا سلول ها در600mL از محلول تریس بافری (Tris (PH: 7.5ـHCL حاوی محلول 1 میلی مولار فنیل متیل سولفونیل فلوراید (PMSF)، در حضور غلظت های مختلف Triton 100-X یا NP40 سوسپانسیونه شدند و سپس سونیکیت شدند. عملکرو سونیکیشن با توان پروب های مختلف اولتراسوند صورت گرفت. لیزات سلولی سانتریفیوژ شده و سوپرناتانت حاصله جمع آوری و با15mL از سوسپانسیون 50% گلوتاتیون سفاروز در 4 درجه سانتی گراد برای 3 ساعت انکوبه شدند. ذرات گلوتاتیون سفاروز 3 برابر با بافر شستشو و در آن مجددا سوسپانسیونه شده و در الکتروفورز SDSـPAGE به کار گرفته شدند. جهت تشخیص و شناسایی باندهای پروتئینی ژن ها با رنگ کوماسی برلیانت (CBB) رنگ آمیزی شدند. بهینه ترین حالت برای بیان ژن و تولید پروتئین نوترکیب PEP در غلظت 0.1mgr/mL از IPTG در کشت شبانه باکتری به دست آمد. ما هیچ تفاوت معنی داری در به کارگیری TritonX100 یا NP40 به عنوان شوینده های حلال گر مشاهده نکردیم، هر چند که بهترین غلظت برای هر دو شوینده 0.1%(V/V) مشخص شد. به علاوه مناسبترین شرایط سونیکاسیون جهت تخریب بقایای دیواره سلولی باکتری 340 پالس در 5 دقیقه باشدت 60% در هر Cycle به دست آمد.



کلیدواژگان:

 
 
Title:



Abstract:

Keyword(s):