برای اطلاع از آخرین مقالات علمی و اخبار کرونا(COVID-19) کلیک کنید

مشخصات

عنوان:

ارزیابی بلوغ آزمایشگاهی و فراساختارکمپلکس های تخمک- کومولوس گوسفند پس از انجماد شیشه ای با روش های Conventional ،Cryotop و Solid Surface



گروه تخصصی:  پزشکی

سازمان مجری:  پژوهشکده علوم سلولی (رویان) 

گروه پژوهشی: جنین شناسی

پژوهشگران: 
تاریخ خاتمه:  اردیبهشت 1392

کارفرما: 

خروجی طرح: 
 
تلفن: 23562000-021

نشانی سازمان مجری: تهران، بزرگراه رسالت، خیابان بنی هاشم شمالی، میدان بنی هاشم، خیابان حافظ شرقی، پژوهشگاه رویان
 

چکیده:

هدف این تحقیق بررسی تاثیرات انجماد شیشه ای کمپلکس های تخمک–کومولوس (توده های COC) گوسفند بر بقای توده ها، بلوغ تخمک ها، بیان ژنهای بلوغ و آپوپتوزی، شیوع ناهنجاریهای کروموزومی و تغییرات فراساختاری توده ها بود.
توده های
COC جدا شده دارای کیفیت خوب به چهار گروه، غیرانجمادی کنترل، انجمادیConventional straw ، Cryotop و Solid Surface تقسیم شدند. در گروههای انجمادی Conventional straw و Cryotop، توده های منجمد شیشه ای شده به ترتیب در درون نی انجمادی و بر روی نوک نوارCryotop قرار گرفتند و مستقیما در نیتروژن مایع غوطه ور شدند درحالیکه در گروه انجمادی Solid Surface، توده های منجمد شیشه ای شده پس از قرار گرفتن بر رویCryotop ، ابتدا سرد و سپس به نیتروژن مایع منتقل شدند. پس از بررسی بقا، توده های COC سالم به همراه توده های تازه گروه کنترل، در شرایط آزمایشگاهی بالغ شده و وضعیت هسته ای تخمک ها ارزیابی شد. علاوه بر آن، بیان نسبی ژنهای بلوغ و آپوپتوزی با روش کمی Real-time PCR مورد ارزیابی قرار گرفت و شیوع ناهنجاری کروموزومی نیز با روش کاریوتیپ بررسی شد. در آخر، تغییرات فراساختاری توده های منجمد شده و تخمک های منجمد و بالغ شده نیز بین گروههای مختلف مقایسه شد.
نتایج نشان داد که میزان بقای توده های منجمد و ذوب شده در گروههای
Cryotop و Solid Surface نسبت به گروه Conventional straw بالاتر بود (به ترتیب 2.85±83.84 و 1.72±78.56 در برابر 1.48±63.43P<0.05)، بعلاوه اگر چه در گروه Cryotop، میزان بلوغ تخمک ها شبیه به گروه کنترل بود (3.09±48.81 در برابر 3.01±51.94%) ولی در مقایسه با سایر گروههای انجمادی درصد بالاتری داشت (3.09±48.81 در برابر 1.69±36.60 و 2.51±6.09P<0.05 ). با وجود کاهش بیان نسبی ژنهای بلوغ (GDF9 و BMP15) پس از انجماد شیشه ای، گروه Cryotop در میان گروههای انجمادی، بیشترین بیان را به خود اختصاص داده بود. بالاترین میزان بیان گیرنده BMPRII در گروه کنترل بود، در حالیکه گیرنده ALK5 میزان بیان مشابهی را در تمام گروهها داشت. بیان ژنهای پروآپوپتوزی (بجز Bax) و ضدآپوپتوزی در گروه Cryotop در مقایسه با سایر گروههای انجمادی بیشتر بود. ژن Bax در گروه Solid Surface بیش از حد بیان شده بود. گروه Conventional straw نیز پایین ترین میزان بیان ژنهای آپوپتوزی را نشان داد. میزان شیوع ناهنجاری کروموزومی در گروه Cryotop نسبت به گروه کنترل بیشتر بود (42.5 در برابر 20%،P<0.05 ). همچنین نتایج بررسی های فراساختاری نشان داد که انجماد شیشه ای با روشهای Cryotop و Solid Surface سازمان دهی کلی اووپلاسم را حفظ کرده در حالیکه انجماد Conventional straw این سازمان دهی را بهم ریخته بود. علاوه بر آن پس از انجماد شیشه ای، تعداد واکوئل ها در اووپلاسم افزایش یافت، گروهی از این واکوئل ها به صورت جزیی یا کامل با چربی پر شده و گروهی نیز دارای داربست میکروفیلامنتی بودند. در تمام گروههای انجمادی، توزیع میتوکندریها به حالت گروه گروه در اطراف قطرات چربی در آمده بود و پس از انجماد Conventional straw، میتوکندریهای متسع و حتی پاره نیز مشاهده شدند. اتصالات فاصله دار میان تخمک و سلول های کومولوس اطراف و کمپلکس های اتصالی بین سلول های کومولوس در دو گروه انجمادی Cryotop و Solid Surface به خوبی حفظ شده در حالیکه در گروه انجمادی Conventional staw، سلول های کومولوس زوایدشان را از منطقه شفاف به عقب کشیده بودند. در تخمک های بالغ نیز از تعداد و تراکم گرانولهای قشری پس از انجماد Conventional straw و Solid Surface کاسته شده بود.
در نهایت، انجماد با روش
Cryotop در مقایسه با دو روش انجمادی دیگر روش مطمئنی بنظر رسیده و می تواند بقا، بلوغ پس از ذوب و میزان بیان ژنهای بلوغ را افزایش دهد و همانند گروه کنترل سبب القای مرگ سلولی از طریق مسیر آپوپتوزی گردد. بعلاوه این روش فراساختار توده های COC را نیز بخوبی حفاظت می کند ولیکن کاستی هایی در زمینه حفظ سازمان دهی کروموزومی تخمک از خود نشان می دهد.



کلیدواژگان: انجماد شیشه ای، کمپلکس تخمک-کومولوس، ژنهای بلوغ، ژنهای آپوپتوزی، فراساختار

 
 
Title:



Abstract:

The purpose of this study was to evaluate the effects of the vitrification of sheep cumulus oocyte complexes (COC) on COC viability, oocyte maturation, maturation and apoptotic genes expression, incidence of chromosomal abnormalities and COC ultrastructural changes.
Good quality isolated COC were randomly divided into non-vitrified control, conventional straw, cryotop and solid surface vitrification groups. In the conventional straw and cryotop groups, vitrified COC were respectively loaded by conventional straw and cryotop and plunged directly in liquid nitrogen (LN2) whereas in the solid surface group, vitrified COC were first cooled after loading by cryotops and then plunged in LN2. Follow the viability assement, healthy COC in associated with the fresh COC of the control group were matured in vitro and then nuclear status of oocytes were evaluated. In addition, the expression of maturation and apoptotic genes was investigated by Real-time PCR and the incidence of chromosomal abnormalities was also evaluated by karyotyping. At last, ultrastructural changes of vitrified COC and in vitro matured vitrified oocytes were compared between different groups too.
The results indicated that the mean percentage of viability of vitrified-warmed COC was higher in the cryotop and solid surface groups than that of the conventional straw group (respectively 83.84±2.85 and 78.56±1.72 versus 63.43±1.48%, P<0.05), in addition in the cryotop group, although the mean percentage of oocyte maturation was similar to that in the control group (48.81±3.09 versus 51.94±3.01%), it was significantly higher than the other vitrification groups (48.81±3.09 versus 36.60±1.69 and 6.09±2.51% respectively, P<0.05). However the expression of maturation genes (GDF9, BMP15) was retarded after vitrification and among the vitrification groups, the cryotop group had better expression. The highest expression rate of BMPRII was seen in the control group whereas ALK5 was similar in all groups. The expression rates of pro-(except for Bax) and anti-apoptotic genes were highest in the cryotop group compared to the other vitrification groups. Bax was overexpressed in the solid surface group. Conventional straw group had the lowest expression rate of apoptotic genes. The incidence of chromosomal abnormalities was higher in the cryotop group in comparison with the control group (42.5 versus 20%, P<0.05). Ultrastructural results showed that vitrification by cryotop and solid surface methods preserved the total arrangement of the ooplasm, whereas conventional straw vitrification disturbed the ooplasm organization. Additionally the number of vacuoles in the ooplasm increased after vitrification, some of these vacuoles was filled partially or completely with lipids and some had filamentous scaffolding. In all of the vitrification groups, mitochondria became batched around lipid droplets after vitrification and distended or ruptured mitochondira were also observed after conventional straw vitrification. Gap Junctional connection between the oocyte and surrounding cumulus cells and junctional complexes between the cumulus cells were preserved appropriately in the cryotop and solid surface groups, whereas in the conventional straw group, cumulus cells retracted their projections back from the zona pellucida. Also, in the mature oocytes, the amount and the density of cortical granules were decreased after conventional straw and solid surface vitrification.
In conclusion, cryotop vitrification compared to the other vitrification methods, seemed to be a safe method and could increase the viability, post-warming maturation, maturation gene expression rates and similar to the control group, induce the cell death via apoptotic pathway. Also, this method could preserve COC ultrastructure properly, but it showed significant deficiencies in the maintenance of oocyte chromosomal organization.



Keyword(s): Vitrification, Cumulus-Oocyte Complexes, Maturation genes, Apoptotic genes, Ultrastructure