برای اطلاع از آخرین مقالات علمی و اخبار کرونا(COVID-19) کلیک کنید

مشخصات

عنوان:

فراساختار جنین های دوسلولی موش حاصل از انجماد شیشه ای پس از کشت همزمان با سلولهای Vero



گروه تخصصی:  پزشکی

سازمان مجری:  پژوهشکده علوم سلولی (رویان) 

گروه پژوهشی: جنین شناسی

پژوهشگران: 
تاریخ خاتمه:  بهار 1382

کارفرما: 

خروجی طرح: 
 
تلفن: 23562000-021

نشانی سازمان مجری: تهران، بزرگراه رسالت، خیابان بنی هاشم شمالی، میدان بنی هاشم، خیابان حافظ شرقی، پژوهشگاه رویان
 

چکیده:

در سالهای اخیر مطالعات بسیاری به منظور بهبود روشهای انجماد و ذوب جنین پستانداران انجام شده است و همزمان با جستجو برای یافتن یک روش انجمادی مناسب و ضدیخی که کمترین آسیب را به سلولها وارد کند، کوششهایی نیز در جهت پیدا کردن محیط کشت ایده آلی که بتواند با برآورده کردن نیازهای جنین، محیطی نزدیک به همزمان in vivo آن فراهم کند، صورت گرفته است. از آنجا که کشت جنین پستانداران با سلولهای پیکری باعث افزایش توان رشد و تکامل آنها می شود، پیشنهاد شده است که برای غلبه بر فشارهای وارده بر جنین پس از انجماد می توان از این روش کشت بهره جست. در عین حال محققین به دنبال بررسی عوامل دخیل دیگر در انجماد نیز بوده اند که از جمله می توان به تاثیرات انجماد بر فراساختار سلولهای جنینی و یا انتخاب مرحله تکاملی مناسب که کمترین آسیب به سلولها وارد می شود، اشاره کرد.
در پژوهش حاضر سعی شده است که پس از بدست آوردن غلظت مناسبی از ضد یخ اتیلن گلیکول در انجماد شیشه ای جنین دو سلولی موش، از توان کشت همزمان با سلولهای
Vero در بهبود رشد و تکوین جنینهای منجمد شده سود جست و در ضمن به بررسی تغییرات فراساختاری ایجاد شده بلافاصله پس از انجماد و ردیابی آن بعد از گذشت 24 ساعت کشت پرداخت.
در مرحله اول جنینهای دو سلولی موش پس از تحریک تخمک گذاری و جفتگیری از موشهای ماده بدست آمده و با دو غلظت 10 و 40 درصد از ضد یخ اتیلن گلیکول به روش انجماد شیشه ای منجمد شدند، و پس از ذوب در حضور محلول
PBI محتوی 0.5 مول ساکارز، تکامل آنها به مدت 96 ساعت در محیط کشت بررسی شد. تفاوت معنی دار آماری میان درصد زنده ماندن دو غلظت ضد یخ بکار رفته وجود نداشت، اما رشد و تکوین جنینهایی که با غلظت کمتر (10% اتیلن گلیکول) منجمد شده بودند بهتر بود (P<0.001).
در مرحله دوم غلظت 10% اتیلن گلیکول انتخاب شده و پس از بدست آوردن تعدادی جنین دو سلولی به دو گروه آزمون و شاهد تقسیم شدند. گروه آزمون با غلظت 10% اتیلن گلیکول منجمد شده و پس از ذوب در محیط کشت همزمان
T6+Vero به مدت 96 ساعت کشت داده شدند. نتایج نشان داد که کشت همزمان قادر است رشد و تکامل جنینهای منجمد شده را بهبود بخشیده و به گروه شاهد نزدیک کند (P<0.001).
اما از آنجا که میزان درصد جنینهایی که در این سیستم کشت همزمان به مرحله خروج از زونا رسیدند، قابل قبول نبود، همه مراحل آزمایش با محیط کشت و
RPMI که با سلولهای Vero همخوانی دارد تکرار شد و مشخص گشت که تفاوت آماری معنی داری میان سیستم کشت همزمان در همه T6+Vero یا به RPMI+Vero مراحل تکاملی غیر از خروج از زونا وجود ندارد، اما درصد بیشتری از جنینها توانستند در محیط کشت همزمان RPMI+Vero مرحله خروج از زونا برسند (P<0.001).
نهایتا به مطالعه فراساختار جنینها پس از انجماد پرداخته شد. به این منظور تعدادی از جنینهای آماده دو سلولی زنده بلافاصله پس از ذوب انتخاب و پس از انجام ثبوت و پردازش برای مطالعه و در
TEM شدند. در ضمن تعدادی از جنینهای منجمد شده که به مدت 24 ساعت کشت همزمان T6+Vero محیط کشت T6 کشت داده شده بودند نیز برای مطالعه TEM انتخاب شدند نتایج این بخش از پژوهش نشان داد که انجماد شیشه ای تغییرات شدید فراساختاری بر میکروویلی های سطح سلول جنینی و مرفولوژی و جایگاه میتوکندری ها را باعث می شود. اما پس از گذشت 24 ساعت کشت بسیاری از این تغییرات جبران شده و فراساختار این جنینها را تا اندازه ای شبیه به گروه شاهد می گردد.
از یافته های پژوهش حاضر می توان دریافت که غلظت پایین تر از ضد یخ اتیلن گلیکول در انجماد شیشه ای جنین دو سلولی موش موفق تر بوده و همچنین کشت همزمان ابزار سودمندی برای افزایش تکوین جنین پستانداران در محیط کشت محسوب شده و می توانند به جنین منجمد شده برای غلبه بر فشارهای ناشی از انجماد کمک کند. درعین حال انجماد شیشه ای باعث تغییرات فراساختاری در سلولهای جنینی می شود اما پس از گذشت مدت زمانی کشت بیشتر این تغییرات از بین می رود.



کلیدواژگان: انجماد شیشه ای، اتیلن گلیکول، سلول Vero، فراساختار جنین

 
 
Title:

Ultrastructure of vitrified 2-cell mouse embryo after co-culture with vero cells



Abstract:

Todays many studies are conducted to improve the cryopreservation methods. Meanwhile it is important to find a proper concentration of the used cryoprotectant. The co-culturing of embryos with helper cells can be similar to the in-vivo environment in order overcome the cryopreservation stresses such as freezing and thawing of the embryos.
Some investigators have tried to find out the ultrastructural changes after cryopreservation and choosing a suitable developmental stage to do cryopresrevation with less damages to embryonic cells.
In this study, the finding of proper concentration of ethylene glycol for two cell mouse embryo vitrification was studied. Secondly the effects of the co-culturing with Vero cells on the development of the vitrified cell embryos were studied.
Finally, the ultrastructural changes immediately after thawing as well as after 24 hrs. culture were also studies.
The two cell embryos were flushed from the excised uteri of the superovulated mice.
In first experiment, the morphologically normal embryos were vitrified using 10% and 40% ethylene glycol solution and thawed rapidly using 0.5 M sucrose solution. The survived embryos were cultured on to medium. The results showed no significant difference between the two groups, but the potential of development of the first group (vitrification with 10% ethylene glycol) was higher than the second group (vitrification with 40% ethylene glycol).
In the second experiment. A lower concentration of the cryoprotectan has been chosen, the two cell embryos were vitrified and co-cultured with vero cells. The results indicated that the developmental potential vitrified co-cultured embryos were higher than the non-co-cultured ones, but the rate of embryos that could hatch, was not optimal. A third experiment was designed using RPMI medium instead of T6 in co-culturing with Vero cells. The results showed that there were no significant differences between the developmental potential of two media. But the hatching rate was better with vero cells which were grown on RPMI, than that embryos co-cultured with vero cells on T6 medium.
Some two cell survived embryos were fixed and processed for TEM study. Accordingly, another group of embryos were prepared after 24 hrs. culture and processed for EM.
The results of the electron microscopic studied in the vitrified embryos showed that the microvilli have disappeared, the mitochondria have displaced with structural changes.
However, these electron microscopic changes were not seen in the embryos from the group which prepared and processed for EM after 24 hrs.
In both co-cultured and non-co-cultured embryos there were no noticeable differences in ultrastructure of co-cultured embryos with non-co-cultured ones.
In conclusion the results of this study confirm that the lower concentration of ethylene glycol in vitrification of two cell mouse embryo is better, while the co-culturing can improve the developmental rate of vitrified two cell mouse embryos. Meanwhile vitrification can produce some ultrastructural changes in embryonic cells.



Keyword(s): vitrification, ethylene glycol, vero cell, embryo ultrastructure