برای اطلاع از آخرین مقالات علمی و اخبار کرونا(COVID-19) کلیک کنید

مشخصات

عنوان:

بررسی آثار هم کشتی و محیطهای کشت متوالی بر میزان دستیابی به بلاستوسیست از اووسیتهای نابالغ گاوی در محیط آزمایشگاهی (جلد سوم)



گروه تخصصی:  پزشکی

سازمان مجری:  پژوهشکده علوم سلولی (رویان) 

گروه پژوهشی: پژوهشی جنین شناسی

پژوهشگران: 
نصراصفهانی محمدحسین (مسئول طرح)
مردانی محمد (همکار طرح)
بهاروند حسین (همکار طرح)
ایمانی حسین (همکار طرح)
صادقی حسین (همکار طرح)

تاریخ خاتمه:  تابستان 1383

کارفرما: 

خروجی طرح: 
 
تلفن: 23562000-021

نشانی سازمان مجری: تهران، بزرگراه رسالت، خیابان بنی هاشم شمالی، میدان بنی هاشم، خیابان حافظ شرقی، پژوهشگاه رویان
 

چکیده:

مقدمه: نظر به اهمیت تولید آزمایشگاهی جنین های گاوی جهت مقاصد علمی و کاربردی تحقیق زیر برای ست آپ کردن روندهای بلوغ لقاح و کشت آزمایشگاهی تخمک های نابالغ گاوی به دست آمده از تخمدان های کشتارگاهی، انجام شد. این مطالعه اولین نمونه این نوع مطالعات در ایران بوده و هدف اصلی آن بهینه سازی کمیت و کیفیت بلاستوسیست، به عنوان مقدمه مطالعاتی مثل تولید گاوهای ترانس ژنتیک، می باشد. امروزه توسعه فن آوری های رویانی، دیدگاه های نوینی را به آینده گشوده است. به هر حال توده سلولی داخلی بلاستوسیست ها نقطه شروع بسیاری از این فن آوری هاست، و این بیانگر لزوم تولید مقادیر قابل توجهی از بلاستوسیت هاست که دارای کیفیتی نزدیک یا برابر با جنین های تولید شده به شکل طبیعی باشند. بنابراین لزوم سازی چنین سیستم هایی از اهداف این مطالعه است.
مواد و روش ها: پس از ست آپ شدن روندهای بلوغ و لقاح آزمایشگاهی 4969 کمپلکس کومولوسی
تخمکی (COC) در طی 57 تکرار و در قالب 7 گروه (6 گروه مورد و یک گروه شاهد) زیر کشت شدند:
1- هم کشتی با سلول های
Vero
2- هم کشتی با سلول های گرانولوزا
3- کشت در محیط متوالی
SOF1 / SOF2
4- کشت در محیط کشت متوالی
G1.2 / G2.2
5- کشت در محیط کشت متوالی
R1 / R2
6- هم کشتی با سلول های
Vero در حضور محیط SOF1 / SOF2
7- کشت در محیط کشت
H-TCM199 (-10% FCS) به عنوان گروه کنترل در هر تکرار مطالعه، یک روند نه روزه، از تخمک نابالغ تا بلاستوسیست، انجام می شد (تحت CO2 %5، O2 %20، حداکثر بخار آب و دمای (39.5°C). COC های آسپیره شده از فولیکول های آنترال mm 2-8 به مدت 24 ساعت در H-TCM199 بالغ شده و سپس در محیط TALP با اسپرم های آماده شده توسط پرکول آمیخته میشدند و جنین های فرضی پس از 24-18 ساعت از زمان آمیختگی گامتها و رتکس شده و به یکی از سیستم های کشت و کنترل آن منتقل می شدند. در روزهای 2، 5 و 7 بعد از لقاح ارزیابی جنین ها برای ثبت میزان جنین های 2، 4، 8 و 16 سلولی، مورولا و بلاستوسیست انجام می شد. در روزهای 2 و 7 بعد از لقاح، درصد تسهیم و درصد بلاستوسیست جنین های حاصله تعیین می شد. در روز 7 بعد از لقاح، تعدادی از بلاستوسیست های منبع جهت شمارش سلولی با روش گیمسا رنگ آمیزی می شدند.
یافته ها: متوسط درصد تسهیم بلاستوسیست در گروه های هفتگانه به ترتیب 84.1، 81.1، 84.6، 82.2، 83.9، 83.1، 84.4% و 27، 22، 20، 4.8، 12.3، 10% بود. گرچه بین این دو پارامتر رابطه معنی داری وجود ندارد
(p>0.05). اما بین عناصر سازنده درصد تسهیم (میزان 2، 4 و 8 سلولی ها) و درصد بلاستوسیست روابط معنی داری وجود دارد (به ترتیب با 0.941، 0.744 و (r=-0.539 (P=0.01)، که بیانگر رابطه منفی میزان 2 سلولی ها و روابط مثبت میزان 4 و 8 سلولی ها، با درصد بلاستوسیست می باشند. همچنین محاسبه دو اندکس جدید از نتایج مرحله اول ارزیابی جنینی، اطلاعات جانبی را در اختیار می گذارد. این دو اندکس چنین محاسبه می شوند:
اندکس 1= 2 سلولی ها / 8 سلولی ها، اندکس 2= 4+2 سلولی ها / 4+8 سلولی ها
بررسی ارتباط این دو اندکس با درصد بلاستوسیست، توسط
bi-vartiant correlate نشان دهنده روابط قابل توجه آماری است (به ترتیب با –0.943 و (r=-0.943 (P=0.01). اندکس اخیر دارای بالاترین قابلیت پیش گویی درصد بلاستوسیست بوده و به علاوه در بر دارنده همه عناصر مرحله اول ارزیابی جنینی است.
با مقایسه نتایج گروهها در می یابیم که هم کشتی با سلول های
Vero با سلول های گرانولوزا و محیط SOF1 / SOF2 بهترین نتایج را داشته اند (P=0.01). در تلاش برای بهینه سازی نتایج، به کمک ترکیب هم کشتی سلول های Vero با محیط SOF1 / SOF2 منجر به درصد بلاستوسیست کمتر (12%) از هر یک از سیستمهای SOF1 / SOF2 و Vero شد.
رنگ آمیزی گیمسا جهت شمارش سلولی در سه گروه اول صورت گرفت و متوسط شمارش سلولی به ظاهر بلاستوسیست به ترتیب 136، 119 و 102 بود. که فاقد تفاوت معنی دار آماری بود.
بحث: علیرغم تفاوت در میزان بلاستوسیست حاصله در گروه های مختلف، تفاوت بارزی بین درصد تسهیم آنها دیده نمی شود. از آنالیز عناصر متشکله درصد تسهیم، چنین به نظر می رسد که سرعت بالاتر تسهیمات اولیه در برخی گروهها منجر به افزایش درصد بلاستوسیست شده است. بالاتر بودن درصد بلاستوسیست در این گروهها بیانگر برآورده سازی بهینه نیازه های اساسی جنین توسط این سیستم هاست. برای مثال سیستم های هم کشتی با در اختیار گذاشت فاکتورهای
embryo- trophic / regulation و یا خنثی نمودن فاکتورهای embryo – toxic جنین را حمایت کرده، و محیط های کشت متوالی با بر طرف نمودن نیازهای دو مرحله ای جنین، امکان رسیدن به بلاستوسیست را افزایش می دهند. شاید علت این واقعیت که تاثیر ترکیب سیستم هم کشتی با سیستم محیط کشت متوالی کمتر از تاثیر هر یک از این دو بوده، ناتوانی سیستم در تامین هم زمان نیازهای جنین و سلول های تک لایه باشد. در نظر داشتن توام نتایج گروهها و شمارش سلولهای بلاستوسیست بیانگر این است که تحت شرایط این مطالعه، استفاده از هم کشتی و محیط SOF1 / SOF2، بهترین سیستمهای تولید بلاستوسیست گاوی محسوب می شوند.



کلیدواژگان: اووسیتهای نابالغ گاوی، بلوغ/ لقاح/ کشت آزمایشگاهی، هم کشتی، محیطهای کشت متوالی، درصد تسهیم، بلاستوسیست

 
 
Title:

(The study of in vitro maturation and vitrification on technique of immature oocytes (Volum 3



Abstract:

Introduction: Due to importance of in – vitro production of bovine embryos for scientific and practical applications, this research was carried out to set up in – vitro maturation, fertilization and culture of immature abattoir – derived bovine oocytes as an endless reservoir of pleuripotent germ cells. This is the first series of these types of studies in Iran and the primary aim of this study was to optimize the quality and quantity of resuting blastocysts as precursors of ongoing studies like production of transgenic cows. Now development of embryo technologies opens new insights to this future. However in many of these technologies, the inner cell masses of blastocysts are the start point and it is necessary to provide large amounts of blastocysts in which the quality appoximates or approaches the quality of in vivo develuping embryos. Therefore such a system need to optimizations, which are the aims of this study.
Material and methods: After setting up the in – vitro maturation and fertilization, 4946 bovine cumulus – oocytes – complexes (COCs) were cultured in 57 replicates in seven culture systems including (six case and one control system):
1- Co – culture with Vero cells
2- Co – culture with bovine granulose cells
3- Culture in SOF1 / SOF2 sequential culture medium (SCM)
4- Culture in, G1.2 / G2.2 sequential culture medium (SCM)
5- Culture in R1 / R2 sequential culture medium (SCM)
6- Co – culture with Vero cells in the presence of SOF1 / SOF2 medium
7- Culture in H-TCM 199 (plus 10% FCS) as the control group.
In each replicate, a nine days follow up coures from immature abattori – derived oocytes to blastocysts was carried out (under 5% CO2, 20% O2, maximum humidity and 39.5°C). The aspireted COCs from 2-8 mm antral follicles, were matured for 24 hours in H-TCM 199, and then were inseminated by Percoll processed sperms in TALP and presumptive zygotes were vortexed after 18-24 h of gamete co – incubation, and finally transferred to one of above described culture system and their controls. The embryos were scored in 2nd, 5th and 7th days post – insemination for recording of 2, 4, 8, 16 cell embryos, morullae and blastocysts. Cleavage and blastocyst rates were determined in 2nd and 7th days post – insemination respectively. Some of the expanded blactocysts were stained with Giemsa at 7th day post – insemination for cell count.
Results: The mean cleavage and blastocyst rates in seven groups were 84.4, 81.1, 84.6, 82.2, 83.9, 82.1, 84.4%% and 27, 22, 20, 4.8, 3, 12, 10% respectively. Statistically, there is no meaningful relations between these two parameters (r=-0.017), however when the relation between the components of cleavage rate (%2 cell, %4 cell and %8 cell embryos) and blastocyst rate were evaluated, reliable relations were found (r=_0.539, 1.744 and 0.941 respectively and P value=0.01), indicating negative relation between 2 cells and blastocyst rate and positive relation between 4 and 8 cells and blastocysts rate. Calculation of two new indices indices from results of first stage of embryo scoring also provided useful data. These are:
Index 1= 2cells / 8cells, index 2= 2+4 cells / 4+8 cells
Analyzing the relation between these indices and blastocyst rate by bi – variant correlate reveal significant relation (r=_0.943 & _0.972 and P value=0.01). The last index has most significant and prognostic relation for estimation of blastocyst rate. Additionally, this index contains all of elements of first stage of embryo scoring and thus is an integrated holistic index.
Comparing, the data in groups suggest that co – culture either with Vero or bovine granulose cells and SOF1 / SOF2 SCM have the best results (p=0.01). Attemots ro optimizing results by combination of Vero co – culture with SOF1 / SOF2 led to lower blastocyst rate (12%) compared to Vero or SOF1 / SOF2 systems.
Giemsa staining for cell count out for first there systems, and mean totai cells per blastocyst in each system were 102, 119 & 136, respectively with no meaningful differences.
Discussion: The results of this study show no difference in the cleavage rate between different culture systems, even though the blastocyst rate is different between them. However analysis of components of cleavage rate suggest that faster the initial cleavages rate the higher would be the blastocyst formation rate. The higher efficiency of some system indicates that some systems cater more for the initial needs of embryos than other. For example co – culture systems might provide embryos with embryo – trophic / regulating factors and deoxifying embryo – toxic factors, while SCM might cater for the biphasic metabolic requirement of embryos. The fact that combination of co – culture and SCM cannot be as effective as co – culture or SCM alone is due to the fact that, the combination system can not caters for the need of embryo and monolayer at the same time. The results of culture studies togerher with blastocyst cell count suggest that under conditions of this study the best condition for bovine blastocyst production would be co – culture or use of modified sof1 / sof2.



Keyword(s): Bovine immature oocytes, in vitro maturation / fertilization / culture, co – culture, sequential culture media, cleavage rate, blastocyst