برای اطلاع از آخرین مقالات علمی و اخبار کرونا(COVID-19) کلیک کنید

مشخصات

عنوان:

انتقال هسته به اووسیت های موش



گروه تخصصی:  پزشکی

سازمان مجری:  پژوهشکده علوم سلولی (رویان) 

گروه پژوهشی: 

پژوهشگران: 
تاریخ خاتمه:  1385

کارفرما: 

خروجی طرح: 
 
تلفن: 23562000-021

نشانی سازمان مجری: تهران، بزرگراه رسالت، خیابان بنی هاشم شمالی، میدان بنی هاشم، خیابان حافظ شرقی، پژوهشگاه رویان
 

چکیده:

مقدمه: کلونینگ (cloning)، به معنی تولید مثل به روش غیر جنسی از افراد انتخاب شده به گونه ای است که نسل ایجاد شده از آنها، از نظر محتوای ژنتیکی همتای والد خود باشد. اساس کلونینگ، انتقال هسته سلول (سوماتیک یا بنیادی) به تخمک بدون هسته می باشد. پروسه انتقال هسته شامل دو قسمت می باشد: 1) خروج هسته از تخمک یا (Enucleation) و 2) انتقال هسته از سلول اهدا کننده به اووسیت بدون هسته یا Nuclear Transfer تخمک به عنوان سیتوپلاست، نقشی اساسی در آغاز و هدایت سیر تکاملی جنین بازسازی شده، دارد. زیرا تخمک نه تنها می تواند به عنوان منبع تغذیه ای در مراحل ابتدایی تکامل جنینی مورد استفاده قرار گیرد، همچنین دارای فاکتورهایی است که جهت Reprogramming هسته اهدایی و تکامل بهتر جنین ضروری است. از این رو یافتن روشی که قادر باشد بدون آسیب رسانیدن به محتوای تخمک و DNA میتوکندری، آن را بی هسته سازد، اهمیت ویژه ای در پیش آگهی کلونینگ خواهد داشت.
هدف: بی هسته سازی تخمک های بالغ و متوقف شده در مرحله
MII (متافاز (II، در موش سوری، نژاد NMRI.
مواد و روش ها: در موش سوری ماده، نژاد
NMRI، تخمک های بالغی که در مرحله MII (متافاز (II بودند، توسط 7.5 واحد بین المللی از PMSG و 7.5 واحد بین المللی از HCG، تحریک به تخمک گذاری شده و تخمکها جمع آوری شد. بر حسب روشی که جهت شناسایی موقعیت کروماتین به کار گرفته شد، تخمک ها در سه گروه قرار گرفتند: روش رنگ آمیزی هوخست و تابش اشعه فرابنفش (گروه هوخست). روش قرار دادن تخمک ها در محیط حاوی سوکروز 3 درصد (گروه سوکروزی). بدون استفاده از رنگ آمیزی، تابش اشعه یا محیط خاص (گروه کنترل). پس از شناسایی محل کروموزوم ها، هسته توسط دستگاه میکرو اینجکشن خارج شد.
نتایج: میزان موفقیت بی هسته سازی یا به عبارت دیگر تعداد تخمک سالم پس از بی هسته سازی در گروه سوکروزی
(%46.8) نسبت به سایر گروهها (هوخست و کنترل) کمتر بوده و تفاوت معنی داری نشان می دهد. بهترین نتایج از گروه کنترل بدست آمد. در گروه هوخستی 112 تخمک بی هسته شده پس از انتقال هسته فعال سازی شد که از این تعداد پس از فعال سازی تعداد (%66.9) 75 جنین فیوز شده و 37 جنین (%33) دژنره شد. از جنین های فیوز شده تعداد 2PN (%86.6) 65 کاذب تشکیل شد که 96 ساعت پس از فعال سازی (%6.5) 4 عدد از جنین ها به مورولا تبدیل شدند.
در گروه شم
105 I تخمک بی هسته شده پس ازانتقال هسته فعال سازی شد که پس از آن تعداد (%57) 60 جنین فیوز شده و 35 جنین (%33) دژنره شد. از جنین های فیوز شده تعداد 2PN (%91.6) 55 کاذب تشکیل شد که 96 ساعت پس از فعال سازی (%3.6) 2 عدد از جنین ها به مورولا تبدیل شدند.
بحث و نتیجه گیری: یافتن روشی که قادر باشد علاوه بر بی هسته سازی موفق تخمک، سلامت آن را نیز تضمین نماید، امری ضروری جهت فراهم نمودن پیش آگهی بهتر در پروسه کلونینگ می باشد. متاسفانه، اغلب رنگ آمیزی یا روش های دیگری (اشعه
UV, X و ) که جهت شناسایی محل کروموزوم به کار می روند، دارای خاصیت تخریب کنندگی DNA میتوکندری و اجزای سیتوپلاسم می باشند. با این حال، در دستانی با تجربه، بی هسته سازی تخمک با کمک دید چشمی و بدون هر گونه استفاده از روش های کمکی، می تواند بیش از 80 درصد با موفقیت همراه باشد. در مطالعه انجام شده نیز بهترین نتایج در بی هسته سازی، همینطور هم کمترین میزان تخمک دژنره در گروه کنترل یک (کروموزوم ها زیر جسمک قطبی) بدست آمد (82 درصد).



کلیدواژگان: کلونینگ، بی هسته سازی، موش

 
 
Title:



Abstract:

Introduction: Cloning is an asexual reproductive method that results in genetically identical offsprigs. The principle of cloning is transfer of a donated uncleus (from a somatic or stem cell) to an enucleated oocyte. Nuclear transfer procedure includes two parts: 1) Enucleation: removal of nucleus from an. 2) Nuclear transfer: transfer of the donated nucleus to the enucleated oocyte. The role of oocyte for initiation, and direction the developmental procedure of reconstructed zygote is so important, because it is not only, as a nutritional support? but also has so many important and special factors for reprogramming the donated nucleus and fetal development. Therefore, finding a method that able to enucleate the oocyte without damaging it’s cytoplasm and mitochondrial DNA, is and important prognostic factor of cloning.
Purpose: The goal of this project is the nucleation of the matured mouse oocytes, arrested at MII (metaphase II).
Method and Materials: matured oocytes, arrested at MII, were collected after superovulation by using 7.5IU PMSG, followed by 7.5IU HCG, 48h later. UP to the method using for identifying the location of chromosomes, we arranged 3 groups of oocyte:
1) oocytes stained by Hoechst- 33342, followed by UV irradiation (Hoechst group).
2) oocytes placed in the media contains 3% sucrose that biuldges the chromatin (sucrose group).
3) oocytes that their chromatin identified by the ability of researcher and with no staining, substance or irradiation. After identification of chromatin, enucleation was done by microinjection tool.
Result: The ratio of intact and degenerated oocytes in sucrose group was lower than to all of other groups (46.8%), and has shown a significant difference (p<0.001). On the other hand the best result was achieved from control group with no staining, substance or irradiation.
Conclusion and Discussion: It is no important to find a method that not only able to successfully enucleate the oocyte, but also it would be able to guaranty the oocyte’s integrity.
Most of staining or other substances and methods, used for identifying the location of chromosome, have adverse effects on mitochondrial DNA and cytoplasm is oocytes.
Although in the experienced hands, with no exposure to any substance, enucleation can be done successfully (success rate: 80%). As mentioned previously, in this project, the best result has been achieved in control group
? success rate: 82%, compatible with the results of other studies.



Keyword(s): Cloning, Enucleation, Mice