مشخصات

عنوان:

بررسی اثر تغییرات اپی ژنتیکی سلولهای سوماتیک دهنده هسته (هیپومتیلاسیون) بر روی کفایت رویانهای شبیه سازی شده در گاو



گروه تخصصی:  پزشکی

سازمان مجری:  پژوهشکده علوم سلولی (رویان) 

گروه پژوهشی: 

پژوهشگران: 
تاریخ خاتمه:  تیر 1390

کارفرما: 

خروجی طرح: 
 
تلفن: 23562000-021

نشانی سازمان مجری: تهران، بزرگراه رسالت، خیابان بنی هاشم شمالی، میدان بنی هاشم، خیابان حافظ شرقی، پژوهشگاه رویان
 

چکیده:

جنین های شبیه سازی شده از سلولهای سوماتیک کاملا تمایز یافته سطوح بالاتری از متیلاسیون DNA را در مقایسه با جنین های حاصل از لقاح نشان می دهند. این امر سبب الگوی بیان نامناسب ژنهای ایمپرینتینگ و غیر ایمپرینتینگ می گردد. این الگوی نابجا احتمالا مسئول ناهنجاریهای متعدد در طی تکوین جنین های شبیه سازی شده می باشد. ایجاد تغییراتی در سطوح اپی ژنتیکی سلولهای سوماتیک دهنده هسته ممکن است سبب بهبود تکوین این جنین ها گردد.
هدف از انجام این تحقیق درمان سلولهای فیبروبلاستی پاساژ 5 با ترکیب
5-aza-2'-dc (ترکیبی ممانعت کننده از فعالیت آنزیم DNA متیل ترانسفراز) به مدت 72 ساعت با غلظتهای 0، 0.01، 0.08 و 0.3 میکرومولار به منظور بررسی تاثیر آن بر تکوین آزمایشگاهی جنین های شبیه سازی شده می باشد. علاوه بر این در این تحقیق تاثیر ترکیب 5-aza-2'-dc به مدت 72 ساعت با غلظتهای 0، 0.01، 0.08 و 0.3 میکرومولار بر خصوصیات متعدد سلولی همچون مورفولوژی، رشد و تکثیر سلولی، سیکل سلولی، آپپتوز و مارکرهای اپی ژنیتیکی سلولهای سوماتیک دهنده هسته نیز بررسی می گردد.
ترکیب 5-aza-2'-dc در تمامی غلظتهای استفاده شده سبب کاهش رشد و تکثیر سلولی گردید به گونه ای که با افزایش غلظت این تاثیر افزایش می یابد. به علاوه این ترکیب سبب تغییر مورفولوژی سلولی به خصوص در بالاترین غلظت استفاده شده (0.3 میکرومولار) گردید. در این حالت سلولهای درمان شده با این ترکیب پهن تر بوده و زوائد بیشتری را به نمایش می گذاشتند. درمان سلولهای فیبروبلاستی با این ترکیب سبب افزایش میزان آپپتوز گردید، به گونه ای که با افزایش غلظت این تاثیر افزایش می یابد. غلظتهای پایین ترکیب 5-aza-2'-dc تاثیر اندکی را بر روی سیکل سلولی نشان می دهد. در حالیکه بالاترین غلظت این ترکیب (0.3 میکرومولار) سبب افزایش معنی دار درصد سلولهای فاز G0/G1 در مقایسه با سایر گروهها می گردد. با افزایش غلظت ترکیب 5-aza-2'-dc سطوح استیلاسیون H3K9 افزایش و سطوح متیلاسیون DNA کاهش یافت. درمان سلولهای فیبروبلاستی با غلظتهای 0.01 و 0.08 میکرومولار از ترکیب  5-aza-2'-dcسبب کاهش غیر معنی دار (%5.3±28.6 و %1.2±27.2 در مقابل %4.3±32.1) درصد بلاستوسیست در مقایسه با گروه کنترل و کاهش معنی دار (%1.5±6.5) در گروه درمانی 0.3 میکرومولار گردید. کیفیت جنین ها (TCN) با افزایش غلظت ترکیب 5-aza-2'-dc کاهش یافت به گونه ای که این کاهش در گروههای تیماری 0.08 و 0.3 میکرومولار در مقایسه با گروههای 0 و 0.01 میکرومولار معنی دار می باشد. مارکرهای اپی ژنتیکی (متیلاسیون DNA و استیلاسیون هیستونها (H3K9 در گروههای 0.08 و 0.3 میکرومولار در مقایسه با جننیهای حاصل از لقاح کاهش معنی داری را نشان می دهد در حالیکه این تغییرات در گروههای 0 و 0.01 میکرومولار معنی دار نمی باشد.
نتایج این تحقیق نشان دهنده این است که غلظت 0.01 میکرومولار از ترکیب 5-aza-2'-dc تاثیرات مضر کمتری را در مقایسه با سایر غلظتها دارد. اما با این وجود نتایج این تحقیق نشان دهنده آن است که ترکیب  5-aza-2'-dcترکیب مناسبی جهت تصحیح برنامه ریزی مجدد هسته ای نمی باشد. در مجموع می توان گفت که شاید دمتیلاسیون وسیع ایجاد شده در سطح ژنوم توسط ترکیب 5-aza-2'-dc تاثیرات مضری را بر تکوین آزمایشگاهی جنین های شبیه سازی شده دارد.



کلیدواژگان: سلولهای سوماتیک، متیلاسیون DNA، سلولهای فیبروبلاستی، اپی ژنتیکی

 
 
Title:

Investigation of Epigenetic Modification of Somatic Donor Cells (Hypomethylation) on The Efficiency of Cloned Bovine Embryos



Abstract:

Reconstructed embryos from terminally differentiated somatic cells revealed high levels of genomic methylation which results into inappropriate expression patterns of imprinted and non-imprinted genes. These aberrant expressions are probably responsible for different abnormalities during development of clones. Improvement in cloning competency maybe achieved through modification in epigenetic markers of donor cells.
Our objective was to determine if treatment of donor cells for 72 hours with 5-aza-2'-deoxycytidine (5-aza-2'-dc) (0-0.01-0.08 and 0.3 µM), a DNA methyl transferase inhibitor, improved development and if this treatment can change cellular characteristics in Bovine Ear Fibroblast cells (BEFs) such as cellular morphology, growth, proliferation, cell cycle, apoptosis and epigenetic markers passage 5.
5-aza-2'-dc inhibited cell proliferation at all tested concentrations in a dose dependent manner. Additionally, 5-aza-2'-dc changed morphology of cells, especially at the highest dose. In such a way that untreated cells had significant connection to the substratum compared with treated cells, which appeared elongated and less connected. Moreover 5-aza-2'-dc induced apoptosis in a dose-dependent manner. 5-aza-2'-dc at lower concentration showed little effect on cell cycle. However 0.3 µM 5-aza-2'-dc resulted in an increased cell population at the G0/G1 stage. Increased 5-aza-2'-dc concentrations led to elevated in acetylation of H3K9 and reduction in DNA methylation. In compare to untreated cells. Treating cells with 0.01 and 0.08 µM 5-aza-2'-dc decreased blastocyst rate insignificantly (32.1% vs. 28.6% and 27.2% respectively) while it was significant for 0.3 µM treated cells (6.5%). The quality of embryo (TCN) decreased in a dose-related fashion which reaches to significance level in 0.08 and 0.3 µM 5-aza-2'-dc treated cells in compare with 0 and 0.01 µM 5-aza-2'-dc treated cells. Although reconstructed embryos from 0.08 and 0.3 µM 5-aza-2'-dc treated cells showed lower levels of DNA methylation and histone H3 acetylation. The epigenetic markers of embryos cloned from 0.01 µM 5-aza-2'-dc were remained unchanged.
In conclusion these results show that 0.01 µM 5-aza-2'-dc had less deleterious effects. Nonetheless this chemical is not a suitable choice for modifying nuclear reprogramming. Finally we could conclude that wide genomic hypomethylation induced by 5-aza-2'-dc have deleterious effects on developmental competency of cloned embryos.



Keyword(s): somatic cells, donor cells, DNA methylation, epigenetic markers