برای اطلاع از آخرین مقالات علمی و اخبار کرونا(COVID-19) کلیک کنید

مشخصات

عنوان:

بررسی ماندگاری و سمیت نقاط کوانتومی در رنگ آمیزی سلول های واجد آنتی ژن CD133 در خون بند ناف و سلول های مزانشیمی مشتق از مغز استخوان انسان



گروه تخصصی:  پزشکی

سازمان مجری:  پژوهشکده علوم سلولی (رویان) 

گروه پژوهشی: 

پژوهشگران: 
اقدمی ناصر (مسئول طرح)
وثوق تقی دیزج احمد (همکار طرح)
بهاروند حسین (همکار طرح)
رنجبر وزیری سارا (همکار طرح)

تاریخ خاتمه:  زمستان 1389

کارفرما: 

خروجی طرح: 
 
تلفن: 23562000-021

نشانی سازمان مجری: تهران، بزرگراه رسالت، خیابان بنی هاشم شمالی، میدان بنی هاشم، خیابان حافظ شرقی، پژوهشگاه رویان
 

چکیده:

علی رغم پیشرفت های چشمگیری که در سال های اخیر در عرصه سلول درمانی صورت گرفته است، سوالات بسیاری از جمله نحوه توزیع سلول های پیوند شده و سازوکارهای دخیل در فرایند بهبود تا به امروز بی پاسخ مانده اند. از این روی تصویربرداری و ردیابی سلول ها در درون موجودات زنده به منظور فهم بهتر و ارزیابی دقیق تر اثرات پیوند سلولی امری ضروری به شمار می آید. یک روش تصویربرداری کارآمد ضمن آنکه باید دارای خواص فیزیکی و شیمیایی مناسبی باشد باید بتواند بدون مداخله در فرایندهای زیستی امکان تصویربرداری طولانی مدت از سلول های پیوند شده را نیز فراهم آورد. نقاط کوانتومی، نانوکریستال های معدنی با ویژگی های نوری و فیزیکی منحصر به فردی همچون محدوده تحریک پذیری گسترده، طیف تابشی کم پهنا و قابل تنظیم، نیمه عمر تابشی طولانی مدت، پایداری ویژه در برابر نور و درخشندگی بالا هستند. این مشخصات استثنایی، امکان یک رهگیری طولانی مدت، چند هدفه و حساس مانند تصویربرداری از کل جانور را توسط نقاط کوانتومی فراهم می آورد. با این حال خواص بیولوژیکی آنها به طور کامل شناسایی نشده است و مطالعه حاضر با هدف بررسی ماندگاری و سمیت نقاط کوانتومی در سلولهای واجد CD133 مشتق از خون بند ناف و همچنین سلولهای بنیادی مزانشیمی طراحی و اجرا شده است.
در این مطالعه از نقاط کوانتومی متصل به پلی آرژنین با بار مثبت با سه سایز و طول موج تابشی مختلف 525، 585، 800 برای نشان دار کردن سلول ها استفاده شده و کارآمدی ورود و میزان ماندگاری آنها در سلول ها به طور کمی و کیفی با استفاده از تکنیک فلوسیتومتری و میکروسکوپ فلورسنت مورد ارزیابی قرار گرفته است. همچنین از میکروسکوپ الکترونی گزاره برای بررسی سازوکارهای موثر در فرآیند ورود و جایگاه قرارگیری این نانوذرات استفاده شد. با رنگ آمیزی هم زمان سلول ها توسط نقاط کوانتومی و رنگ غشایی
PKH تاثیر تقسیم سلولی در کاهش میزان نقاط کوانتومی در سلول های در حال تقسیم مورد ارزیابی قرار گرفته است. خروج احتمالی نقاط کوانتومی با هم کشتی سلول ها در شرایط آزمایشگاهی و پیوند به مدل حیوانی با ایجاد ضایعه نخاعی نشان داده شده است. از تمایز سلول های واجد CD133 به رده های خونی و تمایز سلول های بنیادی مزانشیمی به سلول های استخوانی و چربی برای بررسی امکان تداخل نانوذرات با عملکرد های طبیعی سلول استفاده شده است. برای ارزیابی مسمومیت سلولی از آزمون تراوش آنزیم لاکتات دهیدروژناز برای بررسی آسیب به غشا و روش TUNEL برای سنجش شکاف های DNA استفاده گردید.
نتایج به دست آمده نشان می دهد که میزان ورود نقاط کوانتومی متصل به پلی آرژنین با بار مثبت به داخل سلول با توجه به نوع سلول های مورد مطالعه متفاوت بوده و بهترین کارآمدی در ورود مربوط به سلول های بنیادی مزانشیمی است. با این حال میزان ماندگاری علاوه بر نوع سلول به اندازه ذره مورد مطالعه نیز بستگی داشت به گونه ای که نقاط کوانتومی 800 به عنوان بزرگترین نانو ذره مورد بررسی در این مطالعه در مقایسه با دو نانوذره دیگر از ماندگاری بهتری برخوردار بوده و همچنین نقاط کوانتومی در سلول های مزانشیمی در مقایسه با سلول های واجد
CD133 ماندگاری بیشتری دارند. علت این اختلافات می تواند به دلیل سازوکارهای متفاوت فرایندهای ورود و نحوه جایگیری نانوذرات در داخل سلول ها با توجه به نوع نانوذره و نوع سلول باشد. تصاویر حاصل از میکروسکوپ الکترونی از سلول های مزانشیمی نشان می دهد که دو فرایند ماکروپینوسیتوز و اندوسیتوز وابسته به رفت های لیپیدی در ورود نقاط کوانتومی متصل به پلی آرژنین دخالت داشته و اغلب این نانو ذرات در وزیکول های اندوزومی و سیتوپلاسم تجمع پیدا می کنند. به رغم وجود کارایی بالا در ورود، ماندگاری مناسبی از نقاط کوانتومی در سلول ها مشاهده نشد و باتوجه به نوع سلول و اندازه نانوذره زمان خروج از 24 ساعت تا 30 روز متفاوت بود. به نظر می رسد که خروج نانو ذرات در سلول های واجد CD133 عمدتا به واسطه پدیده shedding صورت می پذیرد. داده های به دست آمده از رنگ PKH نشان داد که تفاوت در میزان تقسیم باعث ماندگاری بیشتر نانوذرات در سلول هایی با تقسیمات کمتر می شود. یافته های حاصل از هم کشتی و پیوند سلول های نشان دار شده در مدل حیوانی نشان می دهد که نانوذرات قادرند از سلول ها خارج شده و مجددا وارد سایر سلول ها شوند. نقاط کوانتومی در غلظت 10 نانومولار بدون توجه به نوع نانوذره و یا سلول تداخلی با روند تمایزی سلول ها نداشته و اثری از مسمومیت سلولی در یک بازه زمانی 96 ساعته در هیچ یک از سلول ها مشاهده نشد.
در کل نتایج به دست از مطالعه حاضر نشان می دهد که هرچند نقاط کوانتومی متصل به پلی آرژنین با بار مثبت می توانند با بازده بالایی وارد سلول های بنیادی واجد
CD133 و مزانشیمی شوند ولی از ماندگاری مناسبی برخوردار نیستند. این نانو ذرات قادرند از سلول های نشان دار شده خارج و وارد سایر سلول ها شوند. با این حال نقاط کوانتومی خواص فیزیکی منحصر به فردی داشته و تداخلی با فعالیت های طبیعی سلول ندارند. بنابراین به نظر می رسد که استفاده از سازوکارهای بهبود یافته در روند ورود، توانایی این نانو ذرات را در فرایند ردیابی و تصویر برداری سلول های بنیادی افزایش دهد.



کلیدواژگان: سلول درمانی، ردیابی سلول ها، نقاط کوانتومی، پلی آرژنین، میزان ماندگاری، مسمومیت سلولی

 
 
Title:

Evaluating the stability and toxicity of Quantum dots on Human cord blood CD133+cells and bone marrow-Mesenchymal Stem cells



Abstract:

Despite several promising achievements in the field of cell therapy, dynamic bio-distribution of the transplanted cells and the underlying mechanisms by which these cells can possibly contribute to functional improvements remains to be investigated. In order to evaluate the efficiency of cell-based therapies, non invasive imaging techniques are crucial to follow the therapeutic cell survival, proliferation, migration, and differentiation status. Alongside with the appropriate physio-chemical properties, an efficient imaging method should enable long term imaging of transplanted cells without affecting cell functionality. Quantum dots (QDs) exhibit several unique optical and physical properties, including broad excitation and size tunable narrow emission spectrum, long luminescence lifetime, exceptional photochemical stability, high brightness and large two photon action cross-sections. Such properties provide us long term, multi-target and high sensitive detection such as in vivo whole animal imaging. Mentioning that biological properties of QDs are not fully understood, this project has been designed in order to investigate the stability of QDs in cord blood CD133+ cells and also bone marrow derived Mesenchymal Stem Cells (MSCs).
In the present study, quantum dots conjugated to positive charged arginin-rich peptides with three different sizes and emission (525, 585, and 800) were applied for labeling cells. The efficiency of entrance and stability of nano-particles have been quantitatively and qualitatively evaluated by flow cytometry and fleurescent microscopy respectively. Influential mechanisms controlling QD entrance and their intra-cellular distribution were detected via transmission electron microscope. Moreover to evaluate the correlation between nano-particles dilution and cell division, membranous PKH staining has been employed. By in vitro co-culture system, the possibility of QD leakage has been investigated and transplantation of labeled cells to animal model has been also conducted for in vivo part. Functional impairment was assessed in QD-labeled cells, so that CD133+ cells were differentiated to blood lines and MSCs were induced to adipo/osteo lineages. Cytotoxic effect of QDs on membrane integrity was studied via analyzing results of Lactate dehydrogenase release and TUNEL assay to detect any DNA damages.
According to results, it has been perceived that cell type could influence the entrance efficiency of QD conjugated to arginin peptides. So that QD-labeled MSCs retained their fluorescent signals for longer period of time than CD133+ cells. It was shown that the stability of nano-particles in labeled cells is dependent on particle size in addition to cell type. In a way that in comparison with other nano-particles, QD800 with the largest size perceived more stable in MSCs. Such differences potentially are due to variable internal pathways of nano-particles entrance in different type of cells.
According to transmission electron micrographs, macropinositosis and lipid raft mediated endocytosis are two processes involved in the entrance of QDs to MSCs. Localization in endosomes and QD entrance to cytoplasm were also observed in these cells. Although the efficient labeling, no proper stability of QDs in cells was shown and excretion time, ranging from 24 hours to 30 days was observed depending on particle size and cell type. It was revealed that vesicle shedding and exocytosis have potential involvement in rapid disappearance of nano-particle from CD133+ cells.
Results demonstrated that there was a direct correlation between diminishing QD signals and cellular divisions. In a way that nano-particles were remained longer in cells with less divisions. The in vitro and in vivo studies for the possibility of QD excretion demonstrated that QDs were leaked from labeled cells and released nano-particles were able to re-enter to other cells. The results showed that cell functionality was not affected by QD labeling and no cytotoxicity was observed at concentration of 10 nM regardless of cell type.
It was concluded that despite of the fact that QD conjugated to positive charged arginine-rich peptides could label CD133+ and MSCs efficiency, the proper stability was not shown. These nano-particles were excreted from labeled cells and they were able to re-enter adjacent cells. Meanwhile it was considered that QDs have unique physical properties and normal functionality of labeled cells was not affected by nano-particles, it seems that with modification of entrance mechanisms the application of QDs in stem cell tracking and imaging would be improved.



Keyword(s): Cell therapy, Cell tracking, Quantum dot, Poly-arginin, Stability, Cytotoxicity