برای اطلاع از آخرین مقالات علمی و اخبار کرونا(COVID-19) کلیک کنید

مشخصات

عنوان:

طراحی یک روش ایمونوفلورسانس برای شناسایی اسپرمهای معیوب



گروه تخصصی:  پزشکی

سازمان مجری:  پژوهشکده فنآوریهای نوین علوم پزشکی ابن سینا 

گروه پژوهشی: علوم پایه پزشکی

پژوهشگران: 
صادقی محمدرضا (مسئول طرح)
حجت مهشید (همکار طرح)
طالبیان اصغر (همکار طرح)
قدس رویا (همکار طرح)
آخوندی محمدمهدی (همکار طرح)
مبارکی مرضیه (همکار طرح)

تاریخ خاتمه:  1384

کارفرما: معاونت پژوهش و فناوری جهاددانشگاهی

خروجی طرح: 

- روش طراحی شده را می توان به منظور ارزیابی اسپرم در مراکز درمان ناباروری و آزمایشگاه های تشخیص طبی به کار برد.
- این روش می تواند برای ارزیابی اثر داروها، مواد شیمیایی و یا عوامل محیطی مختلف بر روی کیفیت اسپرم در انسان مورد استفاده قرار گیرد.


نوع: کاربردی

 
تلفن: 22432020-021

نشانی سازمان مجری: تهران، بزرگراه شهید چمران، اوین، دانشگاه شهید بهشتی، انتهای بلوار داخل دانشگاه
 

چکیده:

هدف: اتصال یوبی کوئیتین به مولکولهای هدف، مکانیسمی شناخته شده، در روند تجزیه پروتئین ها در سلولهای یوکاریوتی می باشد. در طی این مکانیسم پروتئین هایی که نیمه عمر آنها به پایان رسیده است از طریق مسیر آنزیمی چند مرحله ایی با واسطه یوبی کوئیتین حذف میگردند. یوبی کوئیتین پروتئینی کوچک دارای 74 آمینو اسید می باشد که سوبستراهای پروتئینی را به سمت لیز پروتئوزومی هدایت می نماید. بررسی های اخیر نشان می دهد که روند یوبی کوئیتینه شدن، در مورد پروتئین های سطح اسپرم های معیوب در مجرای اپی دیدیم انسان و سایر پستانداران نیز به وقوع می پیوندد. بر این اساس سطح اسپرم های معیوب و دچار نقص در عملکرد توسط سلولهای اپیتلیوم مجرای اپی دیدیم به کمک یوبی کوئیتین نشاندار می گردد. بسیاری از اسپرم های نشاندار طی عبور از قسمتهای انتهایی مجرا به کمک مکانیزمی ناشناخته شناسایی و فاگوسیته می شوند و تنها بخش محدودی از این اسپرم ها در انزال دیده می شوند. از این رو یوبی کوئیتین می تواند به عنوان مارکری ایده آل برای کنترل کیفیت اسپرم در مردان مورد استفاده قرار گیرد. هدف از این تحقیق تخلیص پروتئین یوبی کوئیتین از گلبولهای قرمز خون، تولید و تخلیص آنتی بادی اختصاصی علیه یوبی کوئیتین به منظور طراحی روش ایمونوفلورسانس جهت شناسایی اسپرم های معیوب، مقایسه درصد اسپرمهای یوبی کوئیتینه در دو گروه افراد مبتلا به الیگوآستنوتراتوزواسپرمی و افراد نرمال نورموزواسپرمی به روش ایمونوفلورسانس طراحی شده و در نهایت یافتن ارتباط بین میزان اسپرمهای یوبی کوئیتینه با پارامترهای آنالیز سیمن می باشد.
مواد و روشها: ابتدا یوبی کوئیتین از گلبولهای قرمز خونی با دناتوراسیون حرارتی سایر پروتئین ها در دمای
90oC، رسوب دهی بوسیله سولفات آمونیوم و نهایتا کروماتوگرافی بر روی ژل DEAE-Sephadex تخلیص گردید. در مرحله بعد جهت افزایش قدرت تحریک سیستم ایمنی توسط یوبی کوئیتین، ابتدا این پروتئین به کمک گلوتارآلدئید به پلی یوبی کوئیتین تبدیل و به عنوان ایمونوژن در دوزهای مناسب به خرگوش تزریق گردید. پس از تعیین تیتر آنتی بادی در سرم خرگوشی با روش الایزا و خونگیری در حجم مناسب، در مرحله بعد جهت جداسازی آنتی بادیهای سرم خرگوشی، از روش ایمونوافینیتی بر روی ستون کروماتوگرافی جذبی فعال شده با پروتئین A، استفاده گردید. سپس با اتصال یوبی کوئیتین به عنوان لیگاند به ژل CNBr activated sepharose-4B, عبور آنتی بادیهای خرگوشی مرحله قبل از ستون کروماتوگرافی جذبی متصل به یوبی کوئیتین، آنتی بادی اختصاصی علیه یوبی کوئیتین خالص گردید. جهت تائید اختصاصی بودن آنتی بادیهای خالص شده علیه یوبی کوئیتین، تستی به روش الایزا طراحی شد. پس از کونژوگه نمودن آنتی بادیهای حاصل با ماده فلوروکروم، در مرحله بعد جهت ارزیابی اسپرمهای یوبی کوئیتینه در افراد مبتلا به الیگوآستنوتراتوزواسپرمی و افراد نرمال بارور، نمونه های اسپرمی از دو گروه افراد جمع آوری شد و پس از انجام تست های آنالیز سیمن از هر نمونه بر روی لام اسمیر تهیه گردید. سپس لامها با فرمالدئید فیکس و رقت مشخص از آنتی بادی های کونژوگه با ماده فلورسانس بر روی آنها اثر داده شد. در پایان با استفاده از میکروسکوپ اپی فلورسانس، هر نمونه از نظر تعداد اسپرمهای دارای فلورسانس مشخص، در بین جمعیت 200 اسپرم شمارش شده توسط میکروسکوپ نوری بررسی و به صورت درصد گزارش گردید.
نتایج: نتایج الکتروفورز
SDS-PAGE مربوط به یوبی کوئیتین حاصل از ستون تعویض یونی، به صورت تک باند بر روی ژل ظاهر گردید. مقدار پروتئین تخلیص شده، 1mg یوبی کوئیتین به ازای 100ml سلول خونی و 0.6mgآنتی یوبی کوئیتین به ازا 8ml سرم بود. در بررسی ایمونوفلورسانس به کمک آنتی بادی گونژوگه باFITC علیه یوبی کوئیتین، در هر دو گروه، اسپرم ها فلورسانس بالایی را خصوصا در ناحیه سر نشان می دهند. بررسیها نشان داد میانگین تعداد اسپرم های رنگ گرفته در افراد مبتلا به الیگواستنوترازواسپرمی نسبت به افراد نرمال نورموزواسپرمی، به طور کاملا معنی دار بیشتر می باشد. علاوه بر این درصد اسپرمهای یوبی کوئیتینه ارتباط مستقیم با درصد اسپرمهای غیر متحرک و ارتباط منفی با غلظت اسپرمی، درصد اسپرمهای بامورفولوژی سالم، درصد اسپرمهای زنده و درصد اسپرمهای متحرک دارد.
بحث: با توجه به اینکه امروزه تستهای روتین ارزیابی اسپرم و مایع سمینال نمی تواند بررسی دقیقی از عملکرد و قدرت باروری اسپرم در اختیار دهد این روش می تواند به منظور ارزیابی کیفیت اسپرم در افراد کاندید روشهای کمک باروری
ART مورد استفاده قرار گیرد و در مطالعه روش های درمانی مختلف بر روی ارتقای کیفیت اسپرم و نیز مطالعات تجربی به منظور بررسی اثر مواد مختلف و یا عوامل محیطی بر روند اسپرماتوژنز موثر باشد.



کلیدواژگان:

 
 
Title:

Design an Immunofluorecent Method for Detection of Defective Spermatozoa



Abstract:

Ubiquitination is a well known mechanism in protein degradation of Eukaryotic cells, in which many obsolete and corrupted three dimensional structure protein, become marked by covalent attachment of ubiquitin through a multi-step enzymatic pathway. Ubiquitin is a small, 8.5 kDa peptide of 76 amino acid residues that targets such substrates for proteolysis in proteasome. Recent studies showed that an extra cellular ubiquitination process also taking place in the epididymis of humans and other mammals marks protein on the surface of defective sperm. It appears that structurally and functionally defective sperm become surface ubiquitinated by epididymal epithelial cells. A certain portion of ubiquitin-labeled sperm is phagocytosed and the remaining is ejaculated. Hence ubiquitin on the sperm surface could be a good marker of semen quality control in men. The aim of present study is to purify ubiquitin from packed blood cells, to produce and purify antiubiquitin antibodies, to design an immunofluorescence assay for detection of defective sperm, to compare the percentage of ubiquitinated sperm in Oligoasthenoteratozoospermia and Normozoospermia and finally to determine correlations between sperm parameters and sperm ubiquitination.
Material and Methods: Ubiquitin was first purified from packed blood cells by several steps including rapid denaturation of protein at 90°c, precipitation of ubiquitin and other protein in 90% saturated ammonium sulfate and chromatography on DEAE-Sephadex. In the next step to increase the immunogenecity of ubiquitin, cross linking of this protein to form polyubiquitin was attempted by employing glutaraldehyde. The prepared immunogenic polyubiquitin, were injected multiportally in to the rabbit. The reactive antibody was detected against polyubiquitin, using enzyme linked immunoassay. In order to isolate rabbit serum antibody, Protein A affinity chromatography was employed. Free ubiquitin was coupled to CNBr-activated Sepharose 4B so that by passing rabbit antiserum over the column antiubiquitin antibody was purified. Specificity of antibodies was also examined using enzyme linked immunoassay. Finally antiubiquitin antibodies were conjugated with fluorescein isothiocyanate.
In order to evaluate ubiquitinated sperm, semen sample from both Oligoasthenoteratozoospermia and Normozospermia were collected and after performing semen analysis, sperm were coated on coverslips. In the next step, samples were fixed in formaldehyde buffer and sperm surface ubiquitination was evaluated by direct immunofluorescence assay, using FITC-labelled antiubiquitin antibodies. After counting 200 sperm per sample using light microscopy, the percentage of ubiquitinated sperm was recorded on the same field through epifluorescence microscopy.
Results: According to the performed immunofluorescence assay, most defective sperm display typical ubiquitin labeling, especially on the surface of sperm head .The results show number of ubiquitinated spermatozoa in infertile patient with oligoasthenoteratozoospermia was significantly increased in contrast with fertile male.
Moreover, Statistical analysis showed increased sperm ubiquitination was inversely associated with good semen parameters such as normal morphology, sperm viability, progressive motility and sperm concentration and also there was positive correction with immotile sperm.
Discussion: In an attempt to find a good predictive test, this method may provide a reliable, objective assay to evaluate sperm quality in volunteers of Assisted Reproductive Techniques as well as providing the means for a more accurate assessment of male fertility, drug testing and reproductive toxicology.



Keyword(s):