برای اطلاع از آخرین مقالات علمی و اخبار کرونا(COVID-19) کلیک کنید

مشخصات

عنوان:

تعیین خصوصیات سلول های دندریتیک دسی جوا در طی حاملگی موش



گروه تخصصی:  پزشکی

سازمان مجری:  پژوهشکده فنآوریهای نوین علوم پزشکی ابن سینا 

گروه پژوهشی: جنین شناسی

پژوهشگران: 
جدی تهرانی محمود (همکار طرح)
موذنی سیدمحمد (همکار طرح)
زرنانی امیرحسن (مسئول طرح)
شکری فاضل (همکار طرح)
بیات علی احمد (همکار طرح)

تاریخ خاتمه:  1385

کارفرما: معاونت پژوهش و فناوری جهاددانشگاهی

خروجی طرح: 

چاپ چند مقاله در فصلنامه های:
Medical Journal of Reproduction and Infertility
Histochemistry and Cell Biology 2006
Journal of Reproductive Immunology 2006


نوع: بنیادی کاربردی

 
تلفن: 22432020-021

نشانی سازمان مجری: تهران، بزرگراه شهید چمران، اوین، دانشگاه شهید بهشتی، انتهای بلوار داخل دانشگاه
 

چکیده:

جنین نیمی از کروموزوم های خود را از پدر و نیمی دیگر را از مادر به ارث می برد، بنابراین همانگونه که سایر پیوندهای پدری توسط سیستم ایمنی مادر دفع می شود، این انتظار وجود دارد که جنین نیز دفع شود ولی معمولا چنین اتفاقی نمی افتد. تحمل ایمونولوژیک سیستم ایمنی مادر نسبت به پیوند جنین معمایی است که هنوز پاسخ مناسبی به آن داده نشده است. در توضیح تحمل ایمونولوژیک مادر نسبت به جنین فرضیه های متعددی ارائه شده است. دو فرضیه مهم در این مورد، «سرکوب ایمنی و انحراف پاسخ های ایمنی به سمت پاسخ های تیپ II» است. سلول های دندریتیک سلول های عرضه کننده آنتی ژن می باشند که علاوه بر القاء پاسخ های ایمنی قادر به القاء تحمل ایمونولوژیک نیز می باشند. از طرف دیگر مطالعات نشان می دهند که زیرگروه های سلول های دندریتیک قادر به انحراف پاسخ های ایمنی به سمت TH1 یا TH2 می باشند. بنابراین به نظر می رسد که این سلول ها کاندید مناسبی برای برقراری تعادل پاسخ های ایمونولوژیک مادر برعلیه جنین باشند. هدف این پژوهش تعیین خصوصیات سلول های دندریتیک سطح تماس مادر و جنین (دسی جوا) در طی حاملگی موش بود.
مواد و روش ها: در مراحل مختلف حاملگی آلوژنیک موش (Balb/c ×C57BL/6) شامل اوایل، اواسط و اواخر حاملگی طحال و رحم موش ها خارج شد. از هر بافت برش های بافتی منجمد به قطر5µm تهیه و با آنتی بادی ضد CD11c و یکی از آنتی بادی های CD11b، CD8α،CD86 یا CD205 به روش ایمونوهیستوشیمی دورنگی رنگ آمیزی گردید. همچنین در موش های غیر باردار آزمایش مشابهی در فازهای مختلف سیکل استروس انجام گرفت. همچنین فراوانی و لوکالیزاسیون سلول های دندریتیک و همچنین تغییرات آنها در طی حاملگی و فازهای مختلف سیکل استروس در مقاطع بافتی تهیه شده توسط میکروسکوپ مورد مطالعه قرار گرفت. در آزمایش بعدی تاثیر سوپ دسی جوا بر سلول های دندریتیک در عرضه آنتی ژن و القای پاسخ های سیتوکینی لنفوسیت ها مورد ارزیابی قرار گرفت. مایع رویی کشت 48 ساعته سلول های دسی جوای موش های حامله آلوژن (Balb/c ×C57BL/6) در روز دوازدهم حاملگی جمع آوری گردید. سلول های دندریتیک طحال موش های Balb/c با استفاده از یک روش سه مرحله ای شامل هضم آنزیمی بافت توسط کلاژناز، جداسازی سلول های کم چگال با استفاده از گرادیان اپتی پرپ و اتصال به پلاستیک تخلیص گردید. خلوص سلول های دندریتیک به روش ایمونوسیتوشیمی و فلوسیتومتری با استفاده از آنتی بادی ضد CD11c تعیین شد. سلول های دندریتیک در طی کشت شبانه با آنتی ژن پالس شدند در برخی از کشت ها سوپ دسی جوا به نسبت 5%، 10% و 20% به سلول های دندریتیک اضافه شد. این سلول ها به کف پای موش ها تزریق و پس از 5 روز غدد لنفاوی ناحیه ای خارج گردید. سلول های غدد مزبور در مجاورت آنتی ژن کشت داده شده اند. میزان تکثیر لنفوسیت ها در روز چهارم با اضافه کردن تیمیدین رادیواکتیو اندازه گیری شد. همچنین IFNγ و IL10 در مایع رویی کشت سلول های غدد لنفاوی با روش الیزا اندازه گیری شد.
نتایج: نتایج حاصله نشان داد که سلول های دندریتیک در تمام فازهای سیکل استروس در آندومتر موش حضور دارند ولی فراوانی آنها در فاز استروس بیشتر و در فاز پرواستروس کمتر از فازهای دیگر بود. اختلاف معنی داری از نظر نسبت سلول های دندریتیک لنفوئید (CD11c+,CD8a+) / میلوئید (CD11c+, CD11b+) در فازهای مختلف مشاهده نگردید، اگرچه این نسبت در فاز استروس بیشتر از سایر فازها بود. بعلاوه در مقایسه با فاز دی استروس، در فاز استروس تعداد زیادتری از سلول های دندریتیک در اطراف سلول های اپی تلیال غددی متمرکز بودند. تعداد و ایمونوفنوتیپ سلول های دندریتیک طحال در فازهای مختلف سیکل استروس تفاوت معنی داری با یکدیگر نداشت. تقریبا تمام سلول های دندریتیک آندومتر و طحال CD86 و MHCII را بیان می کردند. همچنین بررسی سلول های دندریتیک دسی جوا نشان داد که سلول های دندریتیک در تمام طول حاملگی در دسی جوا حضور دارند. تعداد این سلول ها در اوایل حاملگی بطور معنی داری بیشتر از تعداد آنها در اواسط و یا اواخر حاملگی بود. مطالعه نسبت سلول های دندریتیک لنفوئید (CD11c+,CD8a+) / میلوئید (CD11c+, CD11b+) در مراحل مختلف حاملگی نشان داد که نسبت مذکور در اواسط حاملگی به طور قابل توجهی نسبت به سایر مراحل حاملگی بیشتر است. همچنین مطالعه سلول های دندریتیک طحال موش های حامله نشان داد اگر چه تعداد کل در سلول های دندریتیک اواسط حاملگی کاهش می یابد ولی نسبت سلول های دندریتیک لنفوئید/ میلوئید به طور معنی داری نسبت به اوایل و اواخر حاملگی افزایش پیدا می کند. بررسی توانایی سلول های دندریتیک تخلیص شده از طحال موش در عرضه آنتی ژن نشان داد که سلول های دندریتیک پالس شده با آنتی ژن سبب القاء تکثیر شدید و تولید سطوح بالایی از IFNγ در لنفوسیت ها می شود، ولی تیمار کردن این سلول ها با سوپ کشت سلول های دسی جوا توانایی این سلول ها را در القاء پاسخ تکثیری لنفوسیت ها و القاء تولید IFNγ به طور قابل توجهی مهار می کند. ولی بین گروه آزمون و کنترل از نظر القاء تولید IL10 تفاوت معنی داری مشاهده نشد.
بحث: نتایج حاصله از این پژوهش برای اولین بار نشان داد که سلول های دندریتیک در آندومتر موش های غیر باردار در تمام فازهای سیکل استروس و همچنین در دسی جوای موش های حامله در تمام مراحل حاملگی حضور دارند. افزایش نسبت سلول های دندریتیک لنفوئید به میلوئید (LDC/MDC) در طی فاز استروس (که جفت گیری در آن فاز انجام می شود) و همچنین در تمام دوره های بارداری می تواند در فرایند تولیدمثل سودمند باشد، چرا که سلول های دندریتیک لنفوئید موجب القاء پاسخ تکثیری بسیار محدودی در لنفوسیت های TCD4+ می شوند. ولی این سلول ها سبب انحراف پروفیل سیتوکینی سلول های TH به سمت TH1 نیز می شوند که این سیتوکین ها به طور بالقوه با یک حاملگی موفق ناسازگار هستند. بنابراین، این انتظار وجود دارد که در سطح تماس مادر – جنین عواملی وجود داشته باشند که با تاثیرگذاری بر روی سلول های دندریتیک موجب القاء پاسخ های TH2 شوند. نتایج حاصله از این مطالعه فرضیه فوق الذکر را تایید کرد. نتایج این بررسی نشان داد که فاکتورهای محلول مترشحه از سلول های دسی جوا علاوه بر مهار عرضه آنتی ژن موجب القاء پاسخ های TH2 توسط سلول های دندریتیک می شوند. در مجموع به نظر می رسد که سلول های دندریتیک عوامل تنظیم کننده اصلی سیستم ایمنی موضعی در طی بارداری بوده و تعادل سلول های دندریتیک لنفوئید و میلوئید در دسی جوا پاسخ های ایمنی مادر را در طی حاملگی تحت تاثیر ریز محیط محلول موضع بارداری تنظیم می کند.



کلیدواژگان: سلول های دندریتیک، دسی جوا، TH2 و حاملگی

 
 
Title:

Immunophenotyping of Decidual dendritic cell During Mouse Pregnancy



Abstract:

Objective: The conceptus genome is half paternal and half maternal. It is thus logical to presume that the immune system of mother should reject it, as it does every paternal graft, but this generally does not occur. Tolerance of the semiallogenic fetal graft by the maternal immune system is a medical enigma that has not been answered yet. Several hypotheses have been proposed for tolerance of the mother to the feto-placental “graft”. The two main hypotheses are “immunosuppression “and “a shift to TH2-type immunity” during normal pregnancy. Dendritic cells (DCs) are potent antigen presenting cells capable of inducing immunity as well as tolerance. On the other hand recent works suggest that dendritic cell subsets can influence TH cells differentiation by inducing TH1 or TH2 responses. Therefore these cells could be suitable candidate that mediate the balance of immune responses to the conceptus. The aim of this study was characterization of dendritic cells in feto-maternal interface (decidua) during mouse pregnancy.
Materials and Methods: The uteri and spleens of allopregnant mice (Balb/c× C57BL/6) were removed at early, middle and late stages of pregnancy. Frozen sections 5µm thick were prepared by cryostat and stained with CD11c and CD11b, CD8?, CD86 or CD205 using two-color immunohistochemistry. The same protocol was carried out at different phases of estrous cycle of non pregnant mice. Also frequency and localization of dendritic cells and their changes during pregnancy and different phases of estrous cycle were studied by light microscope. The effect of supernatants from decidual cell cultures on antigen presentation and induction of TH2 responses by Dendritic cells (DC) was also evaluated. Supernatants from short-term cultures of decidual tissues obtained from the uteri of allogenic pregnant mice (BALB/c C57BL/6) on day 12 p.c. Dendritic cells were purified from BALB/c mice spleen by a three step method including collagenase digestion of spleen tissues, selection of low density cells by Optiprep density gradient medium and plastic adherence. The purity of DCs was determined by flow cytometry and immunocytochemistry using anti CD11c Ab. DCs were pulsed with antigen during overnight culture. In some cultures decidual supernatant were added at 5%, 10%or 20% final concentration. Antigen pulsed DCs were injected into the footpads of syngeneic mice and after 5 days draining lymph node cells of immunized mice were cultured in the presence of antigen and proliferation was measured as thymidine incorporation. Also, IFN gamma and IL-10 was measured in the supernatant of Lymph node cells cultures.
Results:
Our results showed that DCs were present throughout the estrous cycle in mice endometrium, but their frequency was highest in estrus and lowest in proestrus. Lymphoid (CD11c+CD8?+)/myeloid (CD11c+CD11b+) DC ratio was also significantly higher in estrus phase .Indeed DCs were present in large numbers around the glandular and luminal epithelium at estrus, relative to those seen at diestrus. The number and immunophenotype of splenic DCs was not statistically different between stages of estrous cycle. Nearly all endometrial and splenic DCs expressed CD86 and MHCII. DCs were present throughout the pregnancy in decidua too. The number of DCs was significantly higher at early compared to middle or late stages of pregnancy. The lymphoid DC (CD11c+CD8+)/myeloid DC (CD11c+CD11b+) ratio(LDC/MDC) was significantly higher in mid gestation compared with other stages. Although Total number of DCs in spleen decreased; the LDC/MDC ratio was significantly elevated in mid gestation. In parallel, it was shown that antigen–pulsed DCs induced a strong proliferate response of T cells and high levels of IFN? production. However treatment of dendritic cells with decidual supernatants markedly blocked their ability to induce antigen-specific lymphocyte proliferation and IFN? production by cultured lymph node cells, but there was no statistically difference between test and control groups in IL-10 production.
Conclusion: Our results demonstrated for the first time that DCs are present in endometrium of non pregnant mice throughout estrous cycle and in decidua of pregnant mice in entire period of pregnancy. Increasing the ratio of LDC/MDC during estrus phase, at which mating occurs, and also entire period of pregnancy might have a beneficial effect on reproduction, because it is known that lymphoid subset of dendritic cells induce a limited CD4+ T cell responses. But lymphoid DCs could potentially shift cytokine profile of responding T cells toward TH1 which is incompatible with successful pregnancy. So some factors should be present at the feto-maternal interface with TH2 promoting activity on DCs. Our experiments supported this hypothesis in that soluble factors released by decidual cells, which besides their blocking effect on antigen presentation, forced DCs to induce a TH2 response. In conclusion it seems that dendritic cells are the key regulators of the local immune system during pregnancy and the balance of lymphoid and myeloid DCs in the decidua regulates the immunological responses in the pregnant state under the influence of soluble microenvironment.



Keyword(s): dendritic cells, decidua, TH2, pregnancy