مشخصات

عنوان:

تولید آنتی بادی پلی کلونال علیه ایمنوگلوبولین های Rhombomys opimus، مخزن اصلی لیشمانیوز پوستی روستایی در مرکز و شمال شرق ایران



گروه تخصصی:  پزشکی

سازمان مجری:  پژوهشکده فنآوریهای نوین علوم پزشکی ابن سینا 

گروه پژوهشی: ایمونوشیمی

پژوهشگران: 
قدس رویا (مسئول طرح)
اخوان امیراحمد (مسئول طرح)
محمودی سیداحمدرضا (همکار طرح)
جدی تهرانی محمود (همکار طرح)
بالای گلی لیلا (همکار طرح)
بابایی مهدخت (همکار طرح)

تاریخ خاتمه:  مرداد 1388

کارفرما: معاونت پژوهش و فناوری جهاددانشگاهی

خروجی طرح: 

ارائه گزارش نهایی طرح


نوع: کاربردی

 
تلفن: 22432020-021

نشانی سازمان مجری: تهران، بزرگراه شهید چمران، اوین، دانشگاه شهید بهشتی، انتهای بلوار داخل دانشگاه
 

چکیده:

زمینه و هدف: ناقلین لیشمانیوز، پشه خاکی های فلبوتومینه ماده می باشند که بزاق آنها همراه با پروماستیگوت های انگل لیشمانیا به داخل پوست تزریق می گردند. بزاق پشه خاکی حاوی مولکول های متعددی از جمله مواد ضد انعقاد و متسع کننده عروق است واین مواد مجموعا پاتوژنیسیته انگل را بالا می برند. پی بردن به ترکیبات ایمونوژن بزاق پشه خاکی و بررسی پاسخ ایمنی میزبان و دانستن روابط متقابل ناقل، انگل و میزبان در طراحی راهبردهای کنترل بیماری بویژه تولید واکسن های ضد لیشمانیا و یا واکسن های Transmission blocking ضروری است. همچنین ردیابی پاسخ ایمنی میزبان های طبیعی نسبت به بزاق پشه خاکی می تواند جهت پایش مواجهه با ناقل به عنوان مارکر خطر انتقال بیماری مورد استفاده قرار گیرد. لذا مطالعه پاسخ ایمنی  Rhombomys opimus (مخزن اصلی بیماری) و همچنین ایمنی زایی بزاق در مقابل عفونت Leishmania major (عامل بیماری) در این جونده ضروری است. با توجه به اینکه برای تشخیص پاسخ ایمنی از تکنیک هایImmunoblotting  و ELISA استفاده میشود و در این تکنیکها نیاز به کنژوگه HRP-Rabbit Anti R. opimus Ig است و این ماده بطور تجاری در دنیا تولید نمیشود، بنابراین تولید این ماده در ایران کاملا ضروری و غیر قابل اجتناب است. در این پژوهش، تولید آنتی بادی پلی کلونال علیه ایمنوگلوبولین هایR. opimus ، مخزن اصلی لیشمانیوز پوستی روستائی در مرکز و شمال شرق ایران برای اولین بار در ایران و جهان انجام شد.
مواد و روشها:  R. opimus Igبا استفاده از ستون جذبی پروتئین G از سرم جانور، تخلیص شده و جهت تولید آنتی بادی پلی کلونال به خرگوش تزریق گردید. تولید آنتی بادی در خرگوش علیه ایمونوگلوبولین های R. opimus و افزایش تیتر آن در تزریقات متوالی با آزمون الایزا سنجیده شد. سپس ستون کروماتوگرافی جذبی با لیگاندR. opimus Ig  ساخته و تخلیص آنتی بادی پلی کلونال با ستون مذکور انجام شد. راکتیویتی آنتی بادیها با آزمون الایزا سنجش و سپس این آنتی بادی با آنزیم(HRP) Horseradish peroxidase  کونژوگه گردید. در نهایت تیتر مناسب کنژوگه مذکور توسط آزمون الایزا بدست آمد.
نتایج: پس از عبور
1.4 سی سی سرم R. opimus از ستون پروتئین G، معادل 4.88 میلی گرم ایمنوگلوبولین بدست آمد و پس از تزریق آن به خرگوش، آنتی بادی Rabbit Anti R. opimus Ig به دست آمده توسط ستونSepharose-4B- Rhombomys opimus Ig  به مقدار 11.5mg از 5 سی سی سرم به دست آمد که بخشی از آن برای کنژوگاسیون با آنزیمHRP  بکار رفت. در نهایت رقت مناسب 1.1000 با استفاده از آزمون الایزا بدست آمد.
بحث: HRP Conjugated Rabbit anti-Gerbil IgG h+l توسط برخی شرکت ها مانند Immunology Consultants Laboratory Inc (ICL)  تولید میگردد ولی بر اساس اطلاعات ما علیه ایمنوگلوبولین های R. opimus به طور اختصاصی کنژوگه آنتی بادی پلی کلونال یا مونوکلونال در هیچ شرکتی چه در داخل و چه در خارج از کشور تولید نمی گردد. کنژوگه تولید شده در این طرح  HRP Conjugated Rabbit Anti- R. opimus Ig می باشد. تولید این کنژوگه در این پژوهش کمک شایانی به انجام مطالعات سرولوژیک و ایمونولوژیک بر روی R. opimus مخزن اصلی لیشمانیوز پوستی روستایی در ایران و برخی کشور های دیگر می کند که میتواند در آینده به کنترل ایمونولوژیک بیماری منجر گردد.



کلیدواژگان: Rhombomys opimus، آنتی بادی پلی کلونال، لیشمانیوز، ایمونوگلوبولین

 
 
Title:

Production of polyclond antibody against Rhombomys opimus Ig, the main reservoir host of zoonotic cutaneous leishmaniasis in northeast and central Iran



Abstract:

Introduction: Phelebotomine sand flies, vectors of leishmaniasis, co-inject Leishmania parasites along with saliva into the skin of the host while feeding. Saliva from phlebotominae sand flies is known to have pharmacological as well as immunomodulatory activities such as vasodilatory and anticlotting effects which exacerbate the infectivity of the parasite. Investigation on immunogenic components of sand fly saliva and the immune response of the host against it, also interaction among the parasite, sand fly and host is necessary to find possible tools to control the disease specially producing anti Leishmania vaccine and/or transmission blocking vaccine. Detecting the immune response of the host to saliva of sand flies can also be used as a marker of transmission risk of the disease. Study on the immune response of Rhombomys opimus, the main reservoir host of  zoonotic cutaneouse leishmaniasis(ZCL) in Central and northeast of Iran, to infection of L. major, the causative agent of the disease, seems to be necessary. HRP conjugated Rabbit anti- R. opimus Ig is needed for immunoblotting and ELISA tests, which are used to find the immune response of the rodents against the sand fly saliva. As this material is not produced commercially in the world, its production in Iran was essential and inescapable. To our knowledge, production of HRP conjugated Rabbit anti- R. opimus Ig has been produced for the first time in Iran and the world as well.
Materials and methods: R. opimus Ig were purified by protein G affinity chromatography column and were injected to rabbit for production of polyclonal antibody. The raising of antibody level against R. opimus Ig in rabbit serum were assessed by ELISA test. Then Seph-4B- R. opimus Ig were prepared and Rabbit anti R. opimus Ig were purified from rabbit ascitis by this column. Reactivity of purified Rabbit anti R. opimus Ig was assessed by ELISA test. This antibody were conjugated to Horseradish peroxidase (HRP) and the optimum titer of HRP-Rabbit anti R. opimus were also determined by ELISA test.
Results: Approximately 4.88 mg Ig were purified from R. opimus serum by Protein G column. Following injections of purified R. opimus Ig to Rabbit, increasing of rabbit anti R. opimus titer were examined using ELISA test. Bleeding from the rabbit was done and from 5 cc rabbit serum about 11.5 mg rabbit anti R. opimus Ig were purified using Seph-4B-R. opimus Ig column. This polyclonal antibody has been conjugated to HRP and the optimum titer was determined as 1/1000 by ELISA test.
Discussion: HRP Conjugated Rabbit anti-Gerbil IgG (h+l) is being produced by a few companies such as Immunology Consultants Laboratory Inc (ICL), but to our knowledge HRP Conjugated Rabbit anti-R. opimus Ig is not produced by any company.
Production of HRP Conjugated Rabbit anti-R. opimus Ig considerably helps serologic and immunologic studies of R. opimus, the main reservoir host of ZCL in Iran as well as some other countries, which can be led to immunologic control of the disease.



Keyword(s): Rhombomys opimus, Polyclonal antibody, Leishmaniasis, Immunoglobulin