مشخصات

عنوان:

تخلیص آنزیم اوره آز، و طراحی کیت اندازه گیری اوره در مایعات بیولوژیک به روش آنزیمی



گروه تخصصی:  پزشکی

سازمان مجری:  واحد علوم پزشکی شهید بهشتی 

گروه پژوهشی: پژوهشی معرفهای تشخیص طبی و فرآورده های بیولوژیک

پژوهشگران: 
تاریخ خاتمه:  زمستان 1382

کارفرما: معاونت پژوهش و فناوری جهاد دانشگاهی

خروجی طرح: 

جهت استفاده در مراکز تحقیقاتی- تشخیصی درمانی (تشخیص طبی) و تولیدی.


نوع: کاربردی

 
تلفن: 5-22439864-021

نشانی سازمان مجری: تهران، ولنجک، جنب بیمارستان طالقانی، دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی، ساختمان شماره 2 جهاددانشگاهی
 

چکیده:

آنزیم اوره آز ازدسته آنزیمهای هیدرولاز می باشد که هیدرولیز اوره (سوبسترای اصلی) را کاتالیز کرده باعث آزادسازی آمونیاک و دی اکسیدکربن می گردد. این آنزیم که در کیتهای آزمایشگاهی برای اندازه گیری اوره در سرم وادرارکاریرد فراوان دارد، یکی از پروتئنهای موجود در دانه لگومینوزها (نخودیان) می باشد. جهت یافتن منبع مناسب برای تولید این آنزیم دانه های متعددی مورد بررسی قرار گرفتند که از میان آنها دانه نخود جهت مطالعه مناسب تشخیص داده شد.
آنریم اوره آز از نخود تا مرحله ای که مناسب استفاده های آنالیتیکی باشد طی چهارمرحله ساده زیر تخلیص شد: استخراج با استن-مرحله گرمایش-رسوب به وسیله اسید و لیوفیلیزاسیون. برای استخراج آنزیم یک قسمت آرد نخود با 5 قسمت استن 20 درصد محتوی یک میلی مولاراتیلن دی اتیل تترااستیک اسید و یک میلی مولار مرکپتواتانول برای 5 دقیقه استیر شد. در مرحله گرمایش مواد معلق در آنزیم خام حذف شد. سپس آنزیم با اسید سیتریک رسوب داده شد ودر بافر فسفات
0.15 مولار حل گردید و نهایتا بعد از سنتری فیوج، آنزیم رالیوفیلیزه نمودیم. با این روش آنزیم حدود 15 قلدخالص شده حدود 60 درصد بازیافت گردید و به ازاء هر کیلو گرم آرد نخود حدود 6 گرم پروتئین بدست آمد. فعالیت ویژه آنزیم نیمه خالص حدود 410 واحد به ازاء یک میلیگرم پروتئین میباشد. پروتئین های دیگری نیز همراه آنزیم وجود داشتند که درمرحله ژل فیلتراسیون مشخص شد. وزن ملکولی آنزیم حدود 480 کیلودالتون تعیین گردید. در قسمت بعد یک روش کالریمتری آنزیمی برای اندازه گیری اوره در مایعات بدن توصیف شد. در این متد آنزیم اوره آز اوره را هیدرولیز نموده تولید آمونیا و دی اکسید کربن می نماید. آمونیای تولیدی با گلوتامین و آدنوزین تری فسفات در حضور آنزیم گلوتامین سنتتاز واکنش می دهد که محصول آن آدنوزین دی فسفات خواهد بود. در واکنش بعدی که بوسیله آنزیمهای پیروات کیناز و پیروات اکسیداز کاتالیز می شود و در سیستمی که نهایتا پراکسید هیدروژن به وجود می آید، آدنوزین دی فسفات سنجش می شود. در آخرین واکنش که بوسیله پراکسیداز کاتالیز می گردد، فنل و آمینوفنازون به عنوان کروموژن استفاده شده اندوپراکسید هیدروژن تولید شده در طول موج 500 یا550 نانومتر اندازه گیری می شود. واکنشها در مدت 15 دقیقه در دمای37 درجه کامل می شوند و با این روش تا میزان 40 میلی مول در لیتر اوره نمونه ها قابل اندازه گیری است.



کلیدواژگان: استخراج، خالص سازی، آنزیم اوره آز، نخود

 
 
Title:

Purification of urease and development of an enzymatic diagnostic kit for detection of urea in biological fluids



Abstract:

Urease was partially purified from jack bean through four simple steps: aceton extraction-heat treatment-acid precipitation and finally lyophilization.
For extraction one part of meal was mixed with five part of 20% acetone containing 1mM EDTA and 1 mM mercaptoethanol or dithiothrietol and stirred for five minutes.
Concentration of acetone adjusted to 35% and solution brought to 40oC and precipitate was removed by centrifugation. Then urease was precipitated by citric acid and dissolved in phosphate buffer and lyophilized. By this method the purity was increased about 15 fold. The recovery was 60% and yield was 6.5g from one Kg bean. The specific activity was 410 units/mg protein. The molecular weight of the enzyme estimated by gel filtration was 480,000.
In further studies we described an enzymatic colorimetric method for urea determination in body fluids. Urease catalyzed urea hydrolysis and produced ammonia.
Ammonia reacts with glutamine and ATP in the presence of glutamine synthetase and ADP produced. ADP then is assayed in reactions catalysed by pyruvate kinase and pyruvatre oxidase and generate hydrogen peroxide. Hydrogen peroxide is measured at 500 or 550nm.
Aminophenazone is used as the chromogen. The reaction is completed in 15 minutes at 37oC. The standard curve is linear up to 40mmol/L of urea.



Keyword(s): Urease, Purification, Enzymatic, Urea, determination