برای اطلاع از آخرین مقالات علمی و اخبار کرونا(COVID-19) کلیک کنید

مشخصات

عنوان:

بررسی کارآیی روش های PCR-RFLP و DHPLC در تشخیص موتاسیونCT677 ژن MTHFR و ارتباط سطح سرمی هموسیستئین با ژنوتیپهای CT وTT و CC677



گروه تخصصی:  پزشکی

سازمان مجری:  پژوهشکده فنآوریهای نوین علوم پزشکی ابن سینا 

گروه پژوهشی: ایمونوشیمی

پژوهشگران: 
باباشمسی محمد (مسئول طرح)
صادقی محمدرضا (همکار طرح)
هادوی رضا (همکار طرح)
لک پور نیکنام (همکار طرح)

تاریخ خاتمه:  دی 1392

کارفرما: 

خروجی طرح: 
 
تلفن: 22432020-021

نشانی سازمان مجری: تهران، بزرگراه شهید چمران، اوین، دانشگاه شهید بهشتی، انتهای بلوار داخل دانشگاه
 

چکیده:

شناسایی موتاسیون های ژنی در تشخیص بیماری، قبل از ظهور علائم بیماری و متمایز شدن درمان اهمیت دارند. در این تحقیق دو روش PCR- RFLP و DHPLC از نظر کارائی در تشخیص موتاسیونC677T ژن MTHFR مورد بررسی قرار گرفت. همچنین ارتباط میزان هموسیستئین سرم با ژنوتیپهای677CC, TT, CT ارزیابی گردید.
یک قطعه 271 بازی DNA از ژن MTHFR که حاوی جایگاه باز شماره 677 ژن می باشد به روش PCR با استفاده از DNA خالص شده از خون به عنوان DNA الگو تکثیر گردید. محصول PCR توسط آنزیم محدودکننده HinfI هضم و جهت تشخیص ژنوتیپ های CC،CT و TT مربوط به جایگاه 677 به روش RFLP آنالیز گردید. محصول PCR را جهت تشکیل هترو دوبلکس و همودوبلکس با نمونه مرجع مخلوط نموده و مستقیما به ستونHelix DVB تزریق گردید.
موتاسیون
C677T در نمونه های موتانت با استفاده از روش DHPLC به صورت پیک چندگانه بر روی کروماتوگرام ظاهر شد در حالی که در نمونه های غیر موتانت تنها به صورت یک پیک ظاهر شد. داده ها حاکی از آنست که DHPLC تمامی فاکتورهای لازم همچون حساسیت، اختصاصیت، سرعت، بی خطر بودن و قابلیت اتوماسیون به عنوان یک روش غربالگری را دارد. در 154 نمونه آنالیز ژن MTHFR، تعداد نمونه های سالم، هتروزیگوت و هموزیگوت به ترتیب 100، 40، و 14 تعیین شد. که 96 سرم مربوط به این ژنوتیپ ها برای اندازه گیری هموسیستئین مورد استفاده قرار گرفت. مقدار متوسط هموسیستئین در نمونه های سالم 13.14، در نمونه های هتروزیگوت 15.06، و در نمونه های هموزیگوت mmol/L 25.62تعیین گردید.
این نتایج نشان دهنده رابطه بین موتاسیون در ژن MTHFR، و افزایش میزان هموسیستئین در خون می باشد. در افزایش میزان هموسیستئین عوامل مداخله گر دیگری مانند جنسیت، سن، کشیدن سیگار، و همچنین ژن های دیگر مانند ژن MTRR وجود دارد که در این بررسی مورد توجه قرار نگرفته است. بهتر است برای اینکه نتایج قابل اطمینان باشد، این عوامل مداخله گر مورد توجه قرار گیرند.



کلیدواژگان: پلی مورفیسم، هموسیستئین، PCR-RFLP ،MTHFR ،677TC ،DHPLC

 
 
Title:

Efficiency assessment of DHPLC and PCR_RFLP methods in detection of 677CT mutation in MTHFR gene and association of serum homocysteine level with 677CC, TT, CT



Abstract:

Identification of genetic mutations is important in diagnosis of disease before emergence of symptoms to distinguish the treatment. In this study, the sensitivity and specificity of PCR-RFLP and DHPLC techniques compared in mutation detection of C677T in the MTHFR gene and the serum homocystein changes in 677CC, TT and CT genotypes were evaluated.
A 271 bp DNA fragment covering the 677 site of MTHFR gene was amplified by PCR using the purified DNA from whole blood as template DNA. The PCR product digested by Hinf1 restriction enzyme and analyzed for detection of CC, TT and CT genotypes in 677 position by RFLP. The PCR products were mixed by references samples, In order to form heteroduplex and homoduplex and directly injected to Helix DVB column.
The C677T mutation distinguished by DHPLC technology as a multiple peak on chromatogram in mutant samples whereas only single peak in non mutant cases. Our data demonstrated that DHPLC has all the necessary factors for a screening technique such as sensitivity, specificity, speed, safety, and the ability to perform automatically. The number of normal, heterozygous and homozygous cases were 100, 40 and 14 respectively in 154 samples. The homocystein level estimated in the serum sample of these cases. The average amounts of homocystein were 13.14, 15.6 and 25.62 mmol/l respectively in normal, heterozygous and Homozygous cases.
These findings indicate the relationship between mutations in the MTHFR gene and increased levels of blood homocysteine. There are some more interfering factors in the increase of blood homocystein like gender, smoking as well as other genes such as MTRR gene where in this review has not been considered. It is better to consider these interfering factors in further studies to get a more reliable result.



Keyword(s): Polymorphism, Homocysteine, PCR-RFLP, MTHFR, 677TC, DHPLC