برای اطلاع از آخرین مقالات علمی و اخبار کرونا(COVID-19) کلیک کنید

مشخصات

عنوان:

ارزیابی کارآیی روش کروماتوگرافی ایمونو افینیته تحت فشار برای حذف پروتئین های دارای فراوانی بالا از پلاسمای انسان



گروه تخصصی:  پزشکی

سازمان مجری:  پژوهشکده فنآوریهای نوین علوم پزشکی ابن سینا 

گروه پژوهشی: ایمونوشیمی

پژوهشگران: 
باباشمسی محمد (مسئول طرح)
متولی زاده اردکانی علی (همکار طرح)
جدی تهرانی محمود (همکار طرح)
سلیمی علی (همکار طرح)
میفور آنا (همکار طرح)

تاریخ خاتمه:  دی 1392

کارفرما: 

خروجی طرح: 
 
تلفن: 22432020-021

نشانی سازمان مجری: تهران، بزرگراه شهید چمران، اوین، دانشگاه شهید بهشتی، انتهای بلوار داخل دانشگاه
 

چکیده:

مقدمه: شناسایی بیومارکرهای پروتئینی یا پپتیدی در مایعات بیولوژیکی مانند سرم، پلاسما و یا مایع نخاعی، بدلیل وجود برخی پروتئین های دارای غلظت بالا همچون آلبومین، ایمونوگلوبولین و چند پروتئین دیگر غالبا دچار مشکل می شود. حذف اختصاصی این پروتئین ها در مطالعات پروتئومیک از اهمیت بالایی برخوردار است، زیرا همپوشانی پروتئین های یاد شده با دیگر پروتئین ها بر روی ژل الکتروفورز دو بعدی مانع بزرگی در روئیت و جداسازی پروتئین های دارای فراوانی کم لیکن مهم از نظر بالینی می باشد. روش هایی برای حذف پروتئین های با غلظت بالا وجود دارند که از این میان روش کروماتوگرافی ایمونوافینیته تحت فشار با اختصا صیت بیشتری عمل می کند.
روشها: در این طرح پس از آماده سازی سیستم
HPLC، نمونه پلاسمای انسان به ستون ایمونوافینیتی تزریق و حداسازی با کمک بافر شستشو تحت فشار مناسبی در شرایط گرادیان انجام پذیرفت. در مرحله بعد پروتئین های متصل شده (با فراوانی بالا) به کمک بافر جداکننده از ستون خارج گردیدند. نمونه پلاسما قبل از تزریق، جزء جدا شده با بافر شستشو و جزء مربوط به پروتئین های با فراوانی بالا جهت بررسی باندهای پروتئینی توسط الکتروفورز SDS-PAGE در شرایط گرادیان (20%-4) بررسی شدند. نمونه های ذکر شده همچنین جهت بررسی وضعیت هم پوشانی بر روی الکتروفورز دو بعدی مطالعه شد.
نتایج و تحلیل: بررسی جزء پروتئین های با فراوانی بالا توسط
SDS-PAGE گرادیان حاکی از وجود 14 باند پروتئینی مورد انتظار بود که ستون قادر به جداسازی آن از پلاسما گشته است، در حالی که این پروتئین ها در جزء جدا شده با بافر شستشو FT)) در شرایط غیر تغلیظ و نیز چندین برابر تغلیظ رویت نشدند. بررسی مقایسه ای پلاسما و جزء FT توسط الکتروفورز دو بعدی نیز نشان دهنده حذف پروتئین های با فراوانی بالا می باشد. نتایج حاکی از آن است که ستون MARS قابلیت حذف زیادی (حدود 95%) از پروتئین های پلاسما را دارد. حذف 14 پروتئین دارای فراوانی بالا از پلاسمای انسان، روئیت پروتئین های با فراوانی کم را در ژل الکتروفورز دو بعدی به میزان زیادی افزایش داده و باعث می شود که بتوانیم پروتئین های باقیمانده را به میزان 40 تا 50 بار تغلیظ نموده و امکان روئیت آنها را جهت انتخاب از روی ژل و استفاده در آنالیز اسپکترومتری جرمی فراهم نماییم.



کلیدواژگان: Proteomics, Multiple removal system, Plasma, Sample preparation

 
 
Title:

Evaluation of the efficiency of high pressure immuno-affinity chromatography method for high abundant plasma proteins depletion



Abstract:

Identification of protein or peptide biomarker in biological fluids such as serum, plasma or SCF is difficult due to the presence of high abundant proteins, i.e. albumin, immunoglobulin and few other proteins. Removal of the high abundant proteins in proteomic studies is very important, As the overlapping of these proteins with low abundant but clinically important proteins is a major challenge in protein separation and identification by two dimensional gel electrophoresis. There are few methods for high abundant proteins depletion, among which the high pressure immuno-affinity method works more accurately. The project process started by HPLC setup and followed by the injection of human plasma sample to immuno-affinity column and separation carried out by washing the column with washing buffer under a suitable pressure in gradient condition. At the next stage, the bound proteins (high abundant) were eluted by elution buffer. The pre injection plasma sample, flow through and elution (high abundant proteins) fractions were evaluated for protein contents by gradient SDS-PAGE (4-20%). These fractions were studied for protein overlapping by two dimensional electrophoresis too. Evaluation of the high abundant proteins fraction by gradient SDS-PAGE indicated that the column could separate 14 expected proteins from plasma, while these proteins were not observed in non-concentrated and several fold concentrated flow though fractions. Comparison of the plasma and FT fraction by two dimensional electrophoresis indicated the removal of high abundant proteins and provided a better view to the increased protein spots.



Keyword(s): Proteomics, Multiple removal system, Plasma, Sample preparation