برای اطلاع از آخرین مقالات علمی و اخبار کرونا(COVID-19) کلیک کنید

مشخصات

عنوان:

استخراج ژن استرپتوکیناز، کلون نمودن، بیان و تخلیص پروتئین نوترکیب



گروه تخصصی: 

سازمان مجری:  پژوهشکده فنآوریهای نوین علوم پزشکی ابن سینا 

گروه پژوهشی: بیوشیمی

پژوهشگران: 
تاریخ خاتمه:  آبان 1386

کارفرما: معاونت پژوهش و فناوری جهاددانشگاهی

خروجی طرح: 

- از این طرح 2 مقاله و 6 خلاصه مقاله استخراج شده و در مجامع علمی چاپ و ارائه گردیده است.


 
تلفن: 22432020-021

نشانی سازمان مجری: تهران، بزرگراه شهید چمران، اوین، دانشگاه شهید بهشتی، انتهای بلوار داخل دانشگاه
 

چکیده:

استرپتوکیناز به عنوان شناخته شده ترین داروی فیبرینولیتیک، مدت مدیدی است در درمان سکته قلبی مورد استفاده قرار می گیرد. مطالعات مقایسه ای انجام شده طی 10 سال گذشته نشان می دهد که امتیاز کمتری نسبت به سایر داروهای ترمبولایتیک مثل tPA ندارد. تحقیقات برای تولید نوترکیب این پروتئین از سال 1984 شروع شد و تا به امروز ادامه یافته است. در تحقیق حاضر سوش استرپتوکوک equisimilis H46A (پر بازده از نظر تولید استرپتوکیناز) برای اولین بار در ایران تهیه شد تا پس از استخراج DNA، عمل استخراج و تکثیر ژن به گونه ای انجام شود که امکان کلون سازی آن در حامل های متعدد به وجود آید و ادامه مطالعات برای تولید تجاری و بومی شدن دانش تولید استرپتوکیناز که سالانه بیش از یک میلیون دلار هزینه خرید 50 هزار آمپول آن می گردد، هموار شود. در همین راستا کلون سازی این ژن در حامل مناسب جهت تولید بالای استرپتوکیناز نوترکیب اتصالی با ویژگی ساده شدن عملیات تخلیص مد نظر قرار گرفت. با چند اصلاح در روش های موجود، محصولات PCR با استفاده از دو پرایمر ابتدایی و یک پرایمر انتهایی و در نظر گرفتن یک جایگاه آنزیم برش دهنده متداول برای دو سر محصولات (کل ORF،bp 1323 و قسمت مربوط به پروتئین بالغ، bp 1245) در حامل pGEX-4T-2 تحت پروموتر قوی tac و قابلیت بیان بالا کلون شد. ساختار های (پلاسمیدها) نوترکیب حاصل (pGEX-1.3-4T-2 و pGEX-1.2-4T-2) پس از تایید با عملیات هضم دو طرفه و تعیین توالی، درون اشریشیاکلی سویه BL21 (DE3) ترانسفورم شدند. ارزیابی میزان بیان و فعالیت استرپتوکیناز نوترکیب در کلنی های حاوی ساختار pGEX-1.2-4T-2، با استفاده از الکتروفورز و تست اختصاصی با سوبسترای S-2251 انجام شد. گزارش ما از مقدار پروتئین نوترکیب بدون اعمال شرایط بهینه حدود 45% پروتئین های کل میزبان است، با فعالیتی حدود 15000 واحد در هر میلی لیتر از محیط کشت LB. استفاده از یک آنزیم برش دهنده برای دو سر ژن، کلون شدن آن را در تعداد زیادی از وکتورهای بیانی امکان پذیر ساخت. مشاهدات ما به چند دلیل دارای اهمیت است: وجود دم اتصالی GST مانع فعالیت استرپتوکیناز نشد، استفاده از حامل pGEX-4T-2 ضمن تولید استرپتوکیناز نوترکیب فعال و با بازدهی فراوان، دم GST را نیز به ابتدای آمینی آن اضافه می کند که از آن برای تخلیص یک مرحله ای و آسان با استفاده از لیگاند گلوتاتیون استفاده شد. بدین صورت که محصول کشت سلولی دارای بیشترین پروتئین استرپتوکیناز تخریب سلولی شد و آنگاه ستون کروماتوگرافی تمایلی شامل پایهCNBr Sepharose 4B با اتصال لیگاند گلوتاتیون به آن طراحی و ساخته شد. محصول تخریب سلولی را از این ستون عبور داده و استرپتوکیناز به همراه GST استخراج گردید. سپس با استفاده از ترومبین، استرپتوکیناز از GST جدا و نهایتا استرپتوکیناز خالص به دست آمد که خلوص آن به روش SDS-PAGE به اثبات رسید. اکنون استخراج و قابل دسترس بودن این ژن، امکان مطالعات دیگر همچون استفاده از دیگر حامل ها، سلولهای بیانی، جهش زایی، کاهش ایمونوژنیسیته و بهینه سازی شرایط تولید (فاکتورهای موثر بر بیان پروتئین مانند دما، نوع محیط کشت، غلظت القا کننده، انواع القا کننده، زمان شروع القا، مدت زمان القا و پیدا کردن فاز لگاریتمی رشد باکتری در هنگام القا) این ماده اولیه دارویی ژنریک در کشور را فرآهم آورده است.



کلیدواژگان: استخراج ژن، کلون سازی، بیان پروتئین نوترکیب، استرپتوکیناز، S.equisimilis H46A؛ حامل pGEX-4T-2

 
 
Title:

Isolation of streptokinase gene, cloning, expression and purification of the recombinant protein



Abstract:

Streptokinase is a common fibrinolytic drug, that is used in therombolytic therapy for long time. To compare with other therombolytic drugs like tPA, it has lot of advantages. The researches on production of the recombinant form of this protein began in 1984 and continued up to now. In the present research the S.equisimilis H46A strain (Capable in high yield of streptokinase (SKC) production) obtained for the first time in I.R.Iran.
After DNA extraction, the gene isolated and amplified in such a way that it’s cloning was possible in various vectors. The studies on commercial production of SKC and domesticating of the technology continued, the annual expense for import of 50000 vials of streptokinase is over one million US $.
In this way the cloning of skc gene in a suitable vector for high yield production of fusion recombinant SKC to simplify its purification was considered. skc gene was amplified by using two forward primers and one reverse primer. A common restriction enzyme, BamHI, was used for both ends of the PCR products (full length and mature section with 1323bp & 1245bp respectively). The PCR products cloned in pGEX-4T-2 vector utilizing a tac promoter with modification in the present methods.
The new constructs (pGEX-1.2-4T-2 & pGEX-1.3-4T-2) confirmed with double digestion and sequencing. The construct transformed in E.coli BL21 (DE3), and finally the expression and activity of the recombinant SKC performed in clones with pGEX-1.2-4T-2 construct by SDS-PAGE and specific chromogenic substrate test.
The conformation tests indicated a successful expression of SKC gene in E.coli using unique restriction enzyme in both two ends made it possible to clone the gene in various vectors. Protein expression with pGEX-1.2-4-2 indicated that the protein produced with an appreciable level in nonexpressive host (DH5?).We report the cloning and expression in E.coli up to 45% of the total cell protein with an activity about to 15000 U/ml of culture, without optimizing the culture condition. These observations are important for several reasons: They indicate that the modified N-terminus of the enzyme encoded by pGEX-1.2-4T-2 does not prevent the function of the streptokinase and also can be used for streptokinase production with predominant outcome (efficiency) and easily purification ability. The cell culture with maximum expression of streptokinase sonicated and passed through the CN.Br activated sepharose-4B column with glutathione ligand, washed and then eluted. The GST-SK linkage digested by thrombin and the purified streptokinase was collected. Thus, its GST tag allowed it to be readily purified by one step affinity chromatography by glutathione ligand, Now, the accessible extracted gene provides the possibility of further studies, such as: the use of other vectors, expression hosts, directed mutation, reducing the immunogenisity & optimization of production condition (effective factors in protein expression, such as: temperature, type of media, inducer concentration, type of inducers, initial time for induction, time of induction and finding exponential growth phase of bacteria at the induction stage) ultimately to produce a suitable form of streptokinase as a generic pharmaceutical product in Iran.



Keyword(s): gene extraction, cloning, Recombinant protein expression, Streptokinase, pGEX-4T-2 vectors, s.equisimilis H46A