برای اطلاع از آخرین مقالات علمی و اخبار کرونا(COVID-19) کلیک کنید

مشخصات

عنوان:

اولترااستراکچر تخمک موش پس از انجماد (جلد اول)



گروه تخصصی:  پزشکی

سازمان مجری:  پژوهشکده علوم سلولی (رویان) 

گروه پژوهشی: جنین شناسی

پژوهشگران: 
تاریخ خاتمه:  بهار 1382

کارفرما: 

خروجی طرح: 
 
تلفن: 23562000-021

نشانی سازمان مجری: تهران، بزرگراه رسالت، خیابان بنی هاشم شمالی، میدان بنی هاشم، خیابان حافظ شرقی، پژوهشگاه رویان
 

چکیده:

جهت مقایسه تاثیر دو روش انجمادی آهسته و شیشه ای با استفاده از دو ضدیخ اتیلن گلیکول (EG) و 1 و 2 پروپاندیول (PROH) بر اولترااستراکچر، میزان زنده ماندن، لقاح و تکامل بعدی تخمک بالغ (متافاز II) موشهای ماده نژاد NMRI با سن شش تا ده هفته انتخاب شدند. به منظور تحریک تخمک گذاری، ابتدا 10 واحد hMG و پس از 48 ساعت، 10 واحد hCG تزریق داخل صفاقی شد. 12 تا 14 ساعت پس از تزریق hCG تخمکها از لوله فالوپ خارج و با استفاده از هیالورونیداز 0.1 درصد توده سلولی کومولوس اطراف تخمک برداشته شد. تخمکهای بالغ با استفاده از ضد یخ اتیلن گلیکول یا 1 و 2 پروپاندیول به روش آهسته (Slow freezing=S) یا شیشه ای (Vitrification=V) منجمد شده و سپس در ازت مایع نگهداری شدند. تعدادی تخمک نیز به عنوان شاهد در نظر گرفته شد. پس از ذوب، تخمکهای منجمد شده و نشده با اسپرم حاصل از اپیدیوم تلقیح شده و در محیط T6 کشت داده شدند. تکوین جنینهای حاصل تا 120 ساعت مورد بررسی قرار گرفت. تعدادی از تخمکها نیز قبل و بعد از تلقیح با استفاده از گلوتارآلدئید 2.5% و تتراکسید اسمیوم 1% فیکس شده و پس از آبگیری، قالبگیری در رزین آرالدیت، برش گیری و رنگ آمیزی با میکروسکوپ TEM مورد بررسی قرار گرفتند. تکامل تمام گروهها با استفاده از آزمون کای مربع مورد بررسی آماری قرار گرفت.
میزان زنده ماندن تخمکهای منجمد شده به روش آهسته با استفاده از اتیلن گلیکول
(SE) و 1و 2 پروپاندیول (SP) به ترتیب 0.56%، 85% و به روش شیشه ای  با استفاده از اتیلن گلیکول (VE) و 1و 2 پروپاندیول (VP) به ترتیب 80% و 6.7% بود. گروههای VE و SP با دو گروه دیگر VP و SE اختلاف معنی داری داشتند (P<0.0001). درصد لقاح در گروههای SE، SP، VE، VP و کنترل به ترتیب 91.2%، 50%، 91.4%، 7% و 92.6% بود. تکامل جنینهای ماحصل به مرحله خروج از قشر شفاف نیز در گروههای مذکور به ترتیب 0%، 29.7%، 0% و 28.6% بود که تفاوت معنی داری از نظر میزان تکامل گروههای SE، SP و VP با گروه شاهد و نیز با گروه VE داشت (P<0.0001). تغییرات فراساختمانی دیده شده در تخمکهای گروه VE قبل از تلقیح در مقایسه با گروه کنترل عبارت بودند از: کاهش فضای زیر قشر شفاف، بر هم خوردن آرایش اسکلت سلولی و تورم مختصری در بعضی از میتوکندریها که پس از تلقیح و چند ساعت انکوباسیون، تماما برگشت پذیر بودند و تغییرات مشاهده شده در تخمکهای SP قبل از تلقیح در مقایسه با گروه کنترل عبارت بودند از: تغییر در غشاء سلول و از بین رفتن میکروویلی ها و صاف شدن آنها، تعدادی از میتوکندریها نیز دچار آماس و تورم شده بودند که این تغییرات پس از تلقیح تخمکها شدیدتر شده به گونه ای که نظم و انسجام سیتوزول کاملا بر هم خورده و سیتوپلاسم دچار وزیکولیشن شدید شده بود. از تعداد میتوکندریها به میزان زیادی کاسته شده و مختصری میتوکندری باقی مانده نیز همگی دچار آماس شدید بودند و به عبارتی شواهدی از مرگ سلولی را نشان می دادند.
بنابراین روش انجماد شیشه ای با استفاده از ضد یخ اتیلن گلیکول به علت درصد بالای تخمکهای زنده پس از ذوب، تکامل خوب جنینهای ماحصل و تغییرات فراساختمانی کم ایجاد شده طی انجماد و ذوب در مقایسه با روش آهسته برای حفظ تخمک مناسب می باشد.



کلیدواژگان:

 
 
Title:

Fertilization and development of frozen-thawed germinal vesicle mouse oocytes



Abstract:

Despite many investigations conduced to improve the methods of occytes cryopreservations, many problems are associated with the cryopreservation ovulated occytes, including spindle disorganization, loss or clumping of microtubles, induce a premature relase of cotical granules, resulting in the hardening of zona pellucida and low fertilization rate. Therefore vitrified of Early preantral follicles (EPF) or Germinal Vesicles (GV) oocytes an alternative approach has been attempte. This study was designed to investigated the finding of proper concentration of ethylenglycol, in vitro maturation, fertilization and 2-cell embryo formation or GV of EPAF mouse oocytes following vitrification before in vitro maturation.
Early preantral follicles with the diameter of 100-130µm were isolated mechanically from 14 days old NMRY mice ovaries. Follicles were vitrified using PBI containing 30% W/V Ficoll, 0.5M Sucrose, 105 mg BSA, 10.7% W/V acetamide and 40% V/V ethylene Glycol (EGFA40) as a cryopreservation solution, thawing performed in one step manner using 0.5M sucrose in PBI and then, transferred to the drops of DMEM-Ham's F12 containing 5%. Intact vitrified and non-vitrified EPAF were cultured in drops in 20µl of culture medium containing 10µg/ml transferrein, 5µm/ml insulin, 100mlU/ml rFSH. At day 2 of culturing, survival follicles in both groups evaluated under invert microscope. EPAF development followed till day 12 culture media renew every two days. At day 12 perovulatory (Antral like formation follicles; AFF) were stimulated with 1.5IU/ml hCG.
Results show that 91.7% of vitrified EPAF was normal. A survival rate of 49% was obtained with 47.7% of surviving vitrified EPAFs reaching AFF, after 12 day culturing compared with 66.1 of non vitrified control EPAFs. There were no significant differences in GVB & MII and 2-cell embryos in two groups.
Germainal vesicle (GV) were isolated mechanically from 4-6 weeks old NMARY mice ovaries. GVs were vitrified using EGAF40. Thawing performed in one step manner, transferred to the drops of media. Vitrified and non-vitrified GVs were cultured in drops of 20µl of DMEM-Ham's F12 containing 5% with 10µg/ml Tranferrein, 5µg/ml isulin, 100IU/ml rFSH, 1.5IU/ml hGC and pure fresh or heated human follicular fluid. After 24 culturing, GV in both groups evaluated under invert microscope. Ovulated oocytes of GV or EPAF inseminated with the capacitated epidydimal sperms of the same strain of mice. Germinal vesicles (GVs), germinal vesicle breakdown (GVB), extrusion of first polar body, fertilization and development of two cells embryos in vitrified and non-vitrified at 2th day of culturing groups were compared.
A survival rat of vitrified GVs in all of groups were 88%-99%. GVs not only in mature DMEM-Ham's F12 with different material material but also matured oocytes were reached to 2-cell embryos. Results shows that vitrified & non-vitrified GVs capable mached to MII from 42^till 25% with DMEM Ham's F12 containing FCS transterrin, insulin, hCG and rFSH while the rate of maturation of GVs in pure heated or non-heated human follicular fluid was very low and the higheit rat of in-vitro maturation was obtained from stimulated ovary with HMG.
In Conclusion, this results demonstrate that vitrified and non-vitrified immature mouse oocytes (GV or EPAF) obtained from unstimulated ovaries under present cultured condition are able to resumption of meiosis to achieve full nuclear maturation post-thaw. In adition matured oocytes in all groups can fertilized and developed to 2-cell embryo but need more investigation.



Keyword(s):