نسخه جدید سایت SID.ir

مشخصات

عنوان:

آماده سازی و به کارگیری نانو ذرات کیتوزان به عنوان نانو حامل ها در انتقال و جذب گاما گلوبولین انسانی در لوله گوارش ماهی قزل آلا رنگین کمان



گروه تخصصی:  کشاورزی و منابع طبیعی

سازمان مجری:  واحد استان مازندران (گزارش طرح های مصوب داخلی) 

گروه پژوهشی: 

پژوهشگران: 
قاسم نژاد حمید (مسئول طرح)

تاریخ خاتمه:  1388-08-08

کارفرما: 

خروجی طرح: 
 
تلفن: 2253521-2253382-0151

نشانی سازمان مجری: بابل، ساری، وصال شیرازی، دانشکده بهداشت (سابق) جهاددانشگاهی،صندوق پستی: 1667-48175
 

چکیده:

در این پروژه تلاش می شود تا از پوسته میگو که به عنوان معضل و ضایعات مزارع پرورش میگو می باشد بهره برداری علمی و اقتصادی شود تا از یک طرف در تهیه کیتوزان مورد استفاده قرار بگیرد و از طرف دیگر به نانو حامل ها در انتقال مواد حساس به آنزیم ها و اسید معده در لوله گوارش استفاده شود.
به طور کلی در قدم اول کیتوزان از اسکلت خارجی میگو استخراج می شود. در ابتدا پوسته های میگو سفید از مرکز تحقیقاتی کمیشان واقع در شمال استان گلستان جمع آوری می شود و پوسته های جمع آوری شده را با آب شیرین به خوبی شست و شو می دهیم و سپس پوسته ها را خشک و با استفاده از آسیاب آن را پودر می کنیم و نمونه های پودر شده را در ظروف شیشه ای میتوان در دمای یخچال به مدت طولانی نگهداری کرد. سپس افدام به استخراج کیتوزان از پوسته های پودر شده می کنیم. روش استخراج کیتوزان به روش شیمیایی می باشد. در روش شیمیایی (نازنین، 2005) استخراج کیتوزان با استفاده از تیمارهای اسیدی و قلیایی به ترتیب برای دمینراله کردن و دپروتئینه کردن پوسته های استخراجی استفاده می شود. اسید مورد استفاده کلرید ریک می باشد که بهترین بازده و راندمان در غلظت 30 درصد این اسید می باشد (نازنین، 2005). اما نکته قابل توجه در این بخش این است که هر چه میزان اسید بالاتر باشد میزان محصول نهایی مورد نظر افزایش می یابد اما از لحاظ اقتصادی و زیست محیطی مناسب نمی باشد (نازنین، 2005). هم چنین برای تیمار قلیایی از هیدرکسید سدیم با غلظت
5.1 نرمال استفاده می شود که این بهترین غلظت برای استخراج می باشد. بعد از این مرحله برای رنگ بری از پرمنگنات پتاسیم 1 درصد به مدت یک ساعت و سپس از اسید اکسالیک 1 درصد به مدت یک ساعت استفاده نموده و محصول بدست آمده را جمع آوری، شست و شو و خشک می کنند. در مرحله بعد، داستیله کردن با استفاده از سدیم هیدرواکسید 50 درصد در اتوکلاو در دمای 121 درجه سانتی گراد و فشار 15 بار به مدت 15 دقیقه صورت می گیرد. سپس آن را فیلتر، شست و شو با آب مقطر تا اینکه pH آن به حد خنثی برسد و سپس آن را در 60 درجه سانتی گراد به مدت 8 ساعت خشک می شود. محصول نهایی بدست آمده دارای رنگ سفید و غیر محلول در آب می باشد که دارای کیفیت مناسب می باشد (نازنین، 2005).
پس از استخراج کیتوزان، یکسری از ویژگیهای مرتبط با کیفیت کیتوزان استخراج شده می بایست صورت بگیرد که شامل محتوی مواد خشک، خاکستر، میزان داستیله شدن، ویسکوزیته، رنگ، میزان حلالیت، بو و مزه، شمارش کلی باکتریها، وزن مولکولی، ظرفیت باند دهندگی با آب و چربی و ریز ساختار مورد بررسی قرار می گیرد چرا که ویژگیهای مذکور در ویژگیهای کاربردی نانو ذرات کیتوزان بسیار مهم می باشند (چن و همکارانش، 2002، شهیدی و همکارانش، 1999). برای بدست آوردن میزان مواد خشک، ابتدا نمونه ها را در آون در دمای 105 درجه سانتی گراد به مدت 1 ساعت قرار داده می شوند و سپس اختلاف وزن بین وزن اولیه (قبل از قرار دادن در آون) و وزن نهایی (بعد از قرار دادن در آون) میزان ماده خشک را به دست می دهد(AOAC, 2003 .
برای بدست آوردن میزان خاکستر نمونه را در کوره در دمای 600 درجه سانتی گراد قرار می دهیم و پس از طی 6 ساعت میزان ماده بدست آمده نشان دهنده میزان خاکستر نمونه می باشد
(AOAC, 2003) . برای بدست آوردن میزان داستیله شدن از روش تیتراسیون استفاده می کنیم که در طی آن کیتوزان دراسیداستیک 0.1 حل می شود و تا تشکیل محلول %0.1 را دهد. سپس با سولفات پلی وینیل پتاسیم 0.0025 نرمال با تولویدن بلو 1 درصد به عنوان شاخص تیتر می شود. میزان محتوی استیل از میزان ماده تیتر شده معین می شود (Tajic et al. 2008) .برای تعیین ویسکوزیته ابتدا کیتوزان را در حلال حاوی اسید استیک 0.1 مولار، کلرید سدیم 0.2 مولار و آب حل می شود. سپس با ویسکومتر ویسکوزیته ان را بدست می آوریم سپس برای تعیین وزن مولکولی از رابطه Mark-Hoodwink استفاده می کنیم که به صورت زیر می باشد.
[h]=KMa
که K و a عددهای ثابت 3.1×10-3 و 1.01 می باشد و M وزن مولکولی و [h] میزان ویسکوزیته کیتوزان می باشد(Tragic et al. 2008) . برای تعیین رنگ از روش رنگ سنجی استفاده می شود و شاخص های a, b و L با استفاده از دستگاه کرومومتر بدست می آید (Campaniello et al. 2008). برای تعیین ظرفیت باند دهندگی با آب و چربی ابتدا 0.5 گرم نمونه را در 10 میلی لیتر آب به مدت یک دقیقه هم می زنیم سپس سی دقیقه آن را ساکن می گذاریم و هر ده دقیقه آن را به مدت 5 ثانیه تکان می دهیم سپس سانتریفیوژ 3200 دور در دقیقه به مدت 25 دقیقه انجام می دهیم. سپس مایع بالا آن را دور ریخته و تیوب را وزن می کنیم و ظرفیت باند دهندگی با آب و چربی را با استفاده از فرمول زیر بدست می آید (Tragic et al., 2008).
ظرفیت باند دهندگی با آب: آب باند شده \ وزن نمونه
100×.
ظرفیت باند دهندگی با چربی: چربی باند شده \ وزن نمونه 100×.
پس از استخراج کیتوزان اقدام به تولید نانو ذرات و بررسی ریز ساختار با استفاده از میکروسکوپ الکترونی استفاده می شود. برای تولید و آماده سازی نانوذرات، ابتدا محلول 0. 2 درصد کیتوزان در محلول 1 درصد اسید استیک حل می شود. سپس تریپلوفسفات 0. 1 درصد در آب مقطر حل می شود و گاما گلوبولین انسانی در محلول اسید استیک با کیتوزان حل می شود تا غلظت گاما گلوبولین انسانی در محلول مذکور به 2 میلی گرم در میلی لیتر برسد و در نهایت این محلول در محلول تریپلوفسفات حل می شود و محلول حاوی نانو ذرات مورد نظد بدست می آید (وانگ و همکارانش، 2008). سپس به بررسی خصوصیاتی همانند شکل، اندازه، پراکندگی و یکنواختی و کارائی کپسوله کنندگی بررسی می شود. برای بررسی ویژگیهایی مثل شکل، اندازه و پراکندگی از میکروسکوپ الکترونی و دستگاه ZETA SIZER استفاده می شود. در میکروسکوپ الکترونی در ابتدا هر نمونه در یک محوطه استوانه ای به ابعاد 2×2×2 میلی متر مکعب قرار می گیرد. سپس به وسیله چاقوی خاصی برش داده می شود و توسط طلا پوشیده می شود و سپس به وسیله نیتروژن مایع (-18oC) منجمد می شود. برای بررسی سطوح داخلی نمونه، قسمت بالایی هر نمونه در بخش آماده سازی برش داده می شود و سپس به مجاور آن انتقال داده می شود تا عمل تصعید در 90 درجه سانتی گراد به مدت 5 دقیه صورت می گیرد. سپس با استفاده از آرگون افکنی به مدت 90 ثانیه نمونه ها با طلا پوشانده می شود. سپس نمونه های طلا پوشیده شده به مرحله ای که عمل تصعید صورت گرفت قرار داده می شود تا در 30 کیلو وات و 5 درجه اسپات اسکن شوند (Jafarpour et al.). همچنین برای بدست آوردن اندازه نانوذرات از دستگاه ZETA SIZER استفاده می شود که اندازه ذرات را روی گراف نشان می دهد (یانگ و همکارانش، 2009). برای بررسی کارایی کپسوله کنندگی نانو ذرات از روش ژانگ و همکارانش (2009) استفاده می شود که در آن نانو کمپلکس از فاز آبی که حاوی گاما گلوبولین آزاد می باشد با استفاده از سانتریفیوژ با سرعت 16000 دور در دقیقه به مدت 30 دقیقه در 15 درجه سانتی گراد جدا می شود و اندیس مورد نظر با استفاده از فرمول زیر بدست می آید:
کل گاماگلوبولین انسانی - گاما گلوبولین آزاد / کل گاماگلوبولین انسانی
100×.
سپس گاما گلوبولین انسانی را با نانو ذرات کیتوزان مخلوط می کنیم و ساختار میکروسکوپی آن را نیز زیر میکروسکوپ الکترونی مورد بررسی قرار می دهیم. سپس مطالعات In vitro را برای بررسی ویژگیهای آزاد سازی این نانو ذرات انجام می دهیم که برای نیل به این هدف، نانو ذرات تولید شده را دو غلظت متفاوت 50-50 و 80-20 (غلظت بین گاما گلوبولین و نانوذرات) و دو pH متفاوت (5.4 و 5.7) در محلول بافر فسفات (100 میلی لیتر) قرار داده می شود. سپس این سوسپانسیون، در حمام متحرک در دمای 18 درجه سانتی گراد نگهداری می شود و در نهایت میزان آزاد سازی در فواصل زمانی معین (20، 40، 60 دقیقه، 2، 6، 12، 24 و 48 ساعت) تعیین می شود که از طریق اندازه گیری میزان گاما گلوبولین آزاد شده در سوسپانسیون صورت می گیرد (یانگ و همکارانش، 2009). سپس مطالعاتIn vivo  بررسی می شود. سپس در هر یک از تیمارها میزان آزاد سازی گاما گلوبولین انسانی اندازه گیری می شود. سپس مطالعات In vivo مورد بررسی قرار می گیرد. در ابتدا کمپلکس نانو ذرات تولید شده با گاما گلوبولین انسانی را به جیره (خوراک کنستانتره) ماهی قزل آلا رنگین کمان اضافه می شود. سپس این جیره در کنار جیره های شاهد به ماهی قزل آلا رنگین کمان (200-150 گرمی) داده می شود. سپس برای بررسی موارد فوق الذکر، اقدام به نمونه برداری از ماهیان در فاصله های زمانی معین می شود. برای نیل به این هدف، در بازه های زمانی 20، 40 و 60 دقیقه اول اقدام به نمونه برداری می کنیم. برای نمونه برداری در هر مرتبه نمونه برداری سه تکرار داریم. برای اخذ نمونه ابتدا از باله دمی ماهی خون گرفته می شود که از سرنگ هپارینه استفاده می شود. سپس خون جمع آوری شده به مدت 2 ساعت در ذمای اتاق نگهداری می شود و سپس در دمای 4 درجه سانتی گراد و به صورت شبانه با سرعت 4000 دور در 4 دقیقه سانتریفیوژ می شود و سرم بدست آمده تا قبل از تجزیه و تحلیل و انجام آزمایش روی آن در دمای 40- نگهداری می شود (دونیل و همکارانش، 1996). سپس ماهی کالبد شکافی می شود و از معده، ابتدای روده، انتهای روده و زوائد پیلوریک نمونه برداری می شود و سپس برای تعیین میزان گاما گلوبولین انسانی مورد آزمایش قرار می گیرد. سپس این نمونه برداریها را در زمانهای 2، 6، 12، 24 و 48 ساعت انجام می دهیم.





 
 
Title:

The preparation and application of chitosan nanoparticles as nanocarrier in transmitting and absorpting Human Gama Globulin(HGG) into digestive tract in rainbow trout



Abstract:

Keyword(s):