3 SID.ir | كلونينگ، بيان و تخليص پروتئين SNAP-25

مشخصات مقاله

 
عنوان مقاله: 

كلونينگ، بيان و تخليص پروتئين SNAP-25

 
نویسندگان: 
 
آدرس:  
* قم، دانشگاه شاهد، دانشكده علوم پايه، گروه زيست شناسي
 
چکیده: 

زمينه و هدف: سم هاي عصبي كلستريديوم آزادسازي نوروترانسميترها را به وسيله پروتئوليز اختصاصي و انتخابي SNAP-25، سيناپتوبروين VAMP و سينتاكسين، مهار مي كنند. پروتئين SNAP-25 يكي از پروتئين هاي تشكيل دهنده مجموعه لنگراندازي (Docking complex) در پايانه هاي عصبي است. اين پروتئين سوبستراي سم عصبي بوتولينوم، سروتيپ هاي A، C و E مي باشد. هر كدام از اين سروتيپ ها به طور اختصاصي و در جايگاه ويژه SNAP-25 را در يك پيوند آميدي برش داده و از تشكيل مجموعه لنگراندازي و در نهايت اگزوسيتوز نورترانسميترها و انتقال پيام عصبي جلوگيري مي كنند. در آزمايشگاه مي توان با توليد SNAP-25 به روش نوتركيب از آن به عنوان سوبستراي سم، در تشخيص تيپ هاي E وA سم بوتوليسم بهره برد. روش بررسي: در اين مطالعه بر آن شديم كه اين پروتئين را به صورت نوتركيب توليد كنيم. براي اين منظور cDNA ژن مورد نظر با استفاده از روش از RNA تام استخراج شده از سلول هاي مغز موش صحرايي تهيه و توسط RT-PCR تكثير شد. محصول PCR روي ناقل pET32a همسانه سازي شد و پروتئين نوتركيب بيان شده به كمك روش وسترن بلاتينگ و با استفاده از آنتي بادي اختصاصي مورد تاييد قرار گرفت و در نهايت با استفاده از يك ستون كروماتوگرافي ميل تركيبي (Ni-NTA) تخليص و با كمك آنزيم اينتروكيناز فيوژن از پروتئين مورد نظر جدا شد.
يافته ها: در اين تحقيق شرايط بهينه براي بيان پروتئين نوتركيب
SNAP-25، استفاده از غلظت يك ميلي مولار IPTG، مدت زمان انكوباسيون 5 ساعت در دماي 37 درجه سانتي گراد تعيين شد. در تخليص پروتئين نوتركيب با استفاده از ستون Ni-NTA، غلظت 250 ميلي مولار ايميدازول باعث جداسازي و تخليص پروتئين نوتركيب شد. هم چنين استفاده از آنزيم اينتروكيناز براي برش فيوژن در دماي 37 درجه سانتي گراد نسبت به دماي محيط نتايج بهتري را به همراه داشت.
نتيجه گيري: پروتئين نوتركيب تخليص شده ساختار خود را در حين تخليص از دست نداده و جهت برش و انجام آزمايشات بعدي مناسب و قابل استفاده مي باشد. از آن جا كه ساير روش هاي تشخيصي سم بوتوليسم از جمله روش استاندارد تزريق به موش بسيار وقت گير مي باشند لذا استفاده از اين محصول نوتركيب به عنوان سوبسترا جهت تشخيص سم در آزمايشگاه مي تواند تا اندازه اي مشكلات موجود در روش هاي قبلي را مرتفع سازد.

 
كلید واژه: 

 
موضوعات مرتبط: 
 
ارجاعات: 
  • ندارد
 
 
مقالات نشریه ای مرتبط: 
 
مقالات همایشی مرتبط: 
 

  چکیده انگلیسی بازدید یکساله 278
 
 
آخرین های بلاگ
ورود به بلاگ مرکز اطلاعات علمی