6 SID.ir | انتقال ژن Hski-1 به لاين سلولي COS-7 به منظور بررسي جايگاه درون سلولي آنزيم
برای اطلاع از آخرین مقالات علمی و اخبار کرونا(COVID-19) کلیک کنید

مشخصات مقاله

عنوان نشریه: 
 
عنوان مقاله: 

انتقال ژن Hski-1 به لاين سلولي COS-7 به منظور بررسي جايگاه درون سلولي آنزيم

 
نویسندگان: 
 
آدرس:  
 
چکیده: 

آنزيم (Site-1-Protease/Subtilisin-Kexin Isozyme-1)S1P/SKI-1 پروتئازي است كه بر خلاف (Precursor Convertase) هاي پستانداران، سوبستراي خود راپس از آمينواسيدهاي غيربازي در توالي توافقي (Arg/Lys)-X-(Hydrophobic)-(L,T)↓-X برش مي دهد. به نظر مي رسد كه آنزيم در ER دستگاه گلژي و يا وزيكول هاي ترشحي وجود دارد ولي احتمالا در دستگاه گلژي فعاليت خود را انجام مي دهد. بررسي جايگاه درون سلولي آنزيم S1P/SKI در لاين سلولي COS-7 هدف اصلي اين تحقيق بوده است. بدين منظور پس از تكثير پلاسميد به روش ماكسي پرپ، سلول هاي COS-7 هدف اصلي اين تحقيق بوده است. بدين منظور پس از تكثير پلاسميد به روش ماكسي پرپ، سلولهاي COS-7 با حامل PIRES (حاوي cDNAي كد كننده S1P/SKI-1-V5) ترانسفكت شد و از آنجايي كه  cDNAي پروتئين EGFP در حامل به عنوان گزارشگر حضور داشت، به روش فلورسانس ميكروسكوپي، سطح بيان و درصد سلولهاي ترانسفكت شده مشخص شد. براي اثبات بيان شدن S1P/SKI-1 وRNAي كل از كشت سلولي ترانسفكت شده استخراج گرديد و پس از بررسي كميت و كيفيت RNAي استخراج شده به روش اسپكتروفتومتري و الكتروفورزژل آگارز، واكنش رونويسي معكوس (RT) با استفاده از پرايمر اليگو dT و آنزيم M-MLV انجام شد. سپس واكنش PCR روي محصول RT انجام شد و وجود قطعه تكثير شده با الكتروفورز محصول PCR بر روي ژل PAGE تاييد شد. سپس ايمونوسيتوشيمي بر روي تك لايه سلولي ترانسفكت شده با استفاده از آنتي بادي بر عليه وصله V5 كه به قسمت پايانه 3 ژن اضافه شده است، انجام شد. وجود سيگنال مثبت در تصاوير ميكروسكوپ فلورسنت انجام موفقيت آميز ترانسفكشن را تاييد كرد. نتايج حاصل از ايمونوسيتوشيمي نشان داد كه آنزيم در ساختارهايي شبيه ER و دستگاه گلژي قرار دارد اما توزيع رنگ آميزي در اطراف هسته بيشتر از قسمتهاي ديگر است. الگوي رنگ آميزي در ايمونوسيتوشيمي ضمن اينكه فرضيات قبلي را در مورد محل استقرار درون سلولي آنزيم تاييد مي كند، پيشنهاد مي كند كه آنزيم ترجيحا در دستگاه گلژي قرار دارد و فعاليت مي كند.

 
کلید واژه: 

 
موضوعات مرتبط: 
 
ارجاعات: 
  • ندارد
 
 
مقالات نشریه ای مرتبط: 
 
مقالات همایشی مرتبط: 
 

  بازدید یکساله 131
 
 
آخرین های بلاگ
ورود به بلاگ مرکز اطلاعات علمی