طراحي روش واكنش زنجيره اي پليمراز كمي نسبي براي بررسي بيان ژن CD40 در سلول هاي دندريتيك پس از مهار با آنتي سنس

كريمي محمدحسين; سهيلي زهراسهيلا; پورفتح اله علي اكبر; سميعي شهرام; موذني سيدمحمد; عطايي زهرا; گرامي زاده بيتا; كواري مهناز; عبدالهي مريم; عبادي پديده

مشخصات مقاله

عنوان نشریه:

پژوهش های آسيب شناسي زيستي (علوم پزشكي مدرس)

اطلاعات شماره:

تابستان 1386 , دوره 10 , شماره 2 ; از صفحه 23 تا صفحه 33 .

عنوان مقاله:

طراحي روش واكنش زنجيره اي پليمراز كمي نسبي براي بررسي بيان ژن CD40 در سلول هاي دندريتيك پس از مهار با آنتي سنس

نویسندگان:

كريمي محمدحسين, سهيلي زهراسهيلا*, پورفتح اله علي اكبر, سميعي شهرام, موذني سيدمحمد, عطايي زهرا, گرامي زاده بيتا, كواري مهناز, عبدالهي مريم, عبادي پديده

آدرس:

* تهران، اتوبان تهران- کرج، کیلومتر 17، شهرک علم و فناوری، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، گروه بیوشیمی

چکیده:

هدف: سلول هاي دندريتيك در تنظيم و كنترل پاسخ هاي ايمني نقش مهمي به عهده دارند. امروزه نظر بر اين است كه از اين سلول ها در درمان بسياري از بيماري ها مي توان استفاده كرد. يكي از راه هاي ايمونوتراپي ايجاد سلول هاي دندريتيك تولروژن از طريق ممانعت از بيان مولكول هاي كمك تحريكي است. CD40 يکي از مولکول هاي کمک تحريکي بوده که با ممانعت از بيان آن از طريق روش هايي مانند آنتي سنس يا SiRNA مي توان به اين مهم (سلول هاي دندريتيک تولروژن) دست پيدا کرد. با توليد سلول هاي دندريتيكي تولروژن مي توان افقي روشن در درمان بسياري از بيماري ها ايجاد نمود و با طراحي RT-PCR كمي براي اندازه گيري ميزان بيان مي توان راه را براي ايجاد اين سلول ها هموار نمود.در اين تحقيق با طراحي آنتي سنس با استفاده از نرم افزارهاي مربوط و منتقل كردن آن به سلول هاي دندريتيكي با استفاده از ماده "ليپوفكتامين Invitrogen) "2000) به سلول دندريتيك تولروژن رسيده ايم.مواد و روش ها: در اين مطالعه سلول هاي دندريتيك از طحال موش Balb/c جدا شد و ميزان خلوص به وسيله فلوسيتومتري بر اساس نشانگر CD11C تعيين شد. رده سلولي BCL1 به عنوان گروه كنترل، بيان كننده CD40 در محيط كشت RPMI – 1640+ %10 FCS كشت داده شدند. با استفاده نرم افزارهاي بيوانفورماتيك Beacon Designer و mfold and Blast آغازگر براي GADPH (به عنوان كنترل داخلي) و CD40 طراحي شد، كيت (Qiagen) RNeasy Plus Mini Kit براي استخراج RNA مورد استفاده قرار گرفت و با تعيين 260.280 O.D و الكتروفورز در آگارز ميزان خلوص تعيين شد. در ادامه كار ابتدا PCR كيفي با استفاده از آنزيم Roche) Fast Hot Start Taq) بهينه شد و سپس بعد از ساخت cDNA با استفاده از كيت (Biorad) IQ sybergreen، RT-PCR كمي براي CD40 بهينه و در نهايت با استفاده از همين كيت منحني استاندارد پس از تهيه رقت هاي مناسب از RNA براي CD40 و كنترل داخلي محاسبه شد. پس از طراحي آنتي سنس با استفاده از نرم افزارهاي بيوانفورماتيك با استفاده از ماده "ليپوفكتامين 2000" انتقال، انجام و با استفاده از RT-PCR كمي ميزان بيان ژن مشخص شد.نتايج: دماي بهينه اتصال با استفاده از شيب Real time PCR و بهترين CT و ΔRn در 95.5 درجه سانتي گراد براي هر دو ژن CD40 و GADPH تعيين و همچنين دماي ذوب PCR حدود 84 درجه سانتي گراد مشخص شد.شب و بازدهي واكنش PCR براي ژن هاي CD40 و GADPH با روش رقت سريال تعيين شد. با استفاده از غلظت نابرابر آغازگرها بازدهي و شيب برابري اين دو ژن با دماي اتصال يكسان تعيين شد.(بازده 96.5: CD40، شيب: 3.408-؛ بازده 94.1: GADPH، شيب: 3.471-)ميزان كاهش بيان ژن پس از انتقال با آنتي سنس 1.64 در سلول هاي دندريتيكي و در رده سلولي 1.32 BCLI تعيين شد.ماده منتقل شده تاثيري روي بيان ژن ندارد. بهترين زمان براي اندازه گيري كاهش بيان ژن 48 CD40 ساعت پس از انتقال در سلول هاي دندريتيكي و رده سلولي BCLI است.نتيجه گيري: در مطالعات مختلف از روش هاي متفاوتي مانند RT-PCR نيمه كمي RT-PCR كمي مطلق و RT-PCR كمي نسبي براي تعيين ميزان بيان ژن هاي مختلف از جمله CD40 استفاده شده است. بررسي ها در اين تحقيق نشان داد كه استفاده از كيت (Biorad) IQ- sybergreen و اليگومر دي اكسي تيميدين براي سنتز cDNA براي رسم منحني استاندارد ژن CD40 بسيار مناسب است (در اين مورد GADPH كنترل داخلي مناسبي است) كه در مقايسه با RT-PCR نيمه كمي دقيق تر و قابل اعتمادتر است.

کلید واژه:

سلول هاي دندريتيك(Q3)CD40(Q3)Real Time PCR(Q2)

چارک 1 این موضوع در حوزۀ علمی خود، در چارک اول تازگی است.
یعنی استقبال پژوهشگران از این موضوع خیلی زیاد است.
چارک 2 این موضوع در حوزۀ علمی خود، در چارک دوم تازگی است.
یعنی استقبال پژوهشگران از این موضوع زیاد است.
چارک 3 این موضوع در حوزۀ علمی خود، در چارک سوم تازگی است.
یعنی استقبال پژوهشگران از این موضوع کم است.
چارک 4 این موضوع در حوزۀ علمی خود، در چارک چهارم تازگی است.
یعنی استقبال پژوهشگران از این موضوع خیلی کم است.

موضوعات مرتبط:

Ldl اکساید اسپلنکتومی استرپتوکک گروه A پروتئاز 3C پمپ پروتونی تری گلیسرید تکامل لاروی رگه های چربی شکمی عقده لنفاوی لووستاتین ملانوماکروفاژ نروپاتی دیابت هموپریتونئوم هیپرکلسترولمیک

مقالات نشریه ای مرتبط:

مقالات همایشی مرتبط:

طرح های مرتبط:

مقالات بین المللی مرتبط:

ارتباط خیلی زیاد ارتباط زیاد مرتبط ارتباط کمتر

ارجاعات:

ثبت نشده است

استنادات:

ثبت نشده است

+جهت ارجاع به این مقاله کلیک کنید(Cite).

APA : کپی

کریمی، م.، و سهیلی، ز.، و پورفتح اله، ع.، و سمیعی، ش.، و موذنی، س.، و گرامی زاده، ب.، و کواری، م.، و عبدالهی، م.، و عبادی، پ.، و عطایی، ز. (1386). طراحی روش واکنش زنجیره ای پلیمراز کمی نسبی برای بررسی بیان ژن CD40 در سلول های دندریتیک پس از مهار با آنتی سنس. پژوهش های آسیب شناسی زیستی (علوم پزشکی مدرس), 10(2), 23-33. https://www.sid.ir/fa/journal/ViewPaper.aspx?id=89102

Vancouver : کپی

کریمی محمدحسین، سهیلی زهراسهیلا، پورفتح اله علی اکبر، سمیعی شهرام، موذنی سیدمحمد، گرامی زاده بیتا، کواری مهناز، عبدالهی مریم، عبادی پدیده، عطایی زهرا. طراحی روش واکنش زنجیره ای پلیمراز کمی نسبی برای بررسی بیان ژن CD40 در سلول های دندریتیک پس از مهار با آنتی سنس. پژوهش های آسیب شناسی زیستی (علوم پزشکی مدرس). 1386 [cited 2022July01];10(2):23-33. Available from: https://www.sid.ir/fa/journal/ViewPaper.aspx?id=89102

IEEE : کپی

کریمی، م.، سهیلی، ز.، پورفتح اله، ع.، سمیعی، ش.، موذنی، س.، گرامی زاده، ب.، کواری، م.، عبدالهی، م.، عبادی، پ.، عطایی، ز.، 1386. طراحی روش واکنش زنجیره ای پلیمراز کمی نسبی برای بررسی بیان ژن CD40 در سلول های دندریتیک پس از مهار با آنتی سنس. پژوهش های آسیب شناسی زیستی (علوم پزشکی مدرس), [online] 10(2), pp.23-33. Available: https://www.sid.ir/fa/journal/ViewPaper.aspx?id=89102.